基于网络药理学探讨麻杏石甘汤治疗急性支气管炎 的作用机制

缪佩凤

(东兴市人民医院，广西 东兴 538051)

0 引言

急性支气管炎主要由感染或其他非感染因素如过敏、吸烟、空气污染等所致，临床表现为咳痰咳痰、发热、喘息等，病理表为气管-支气管黏膜的急性炎症反应，为临床常见的肺系疾病[1,2]。婴幼儿及老年人易发病，好发于冬春季节，且本病起病急骤、变化快甚至可造成患者死亡，因此及时治疗非常必要[1]。

麻杏石甘汤是《伤寒论》中的经典方剂，主要由麻黄，杏仁，石膏和甘草四味中药组成，用于太阳病的治疗，后世多用于治疗风寒化热或风热犯肺，现代临床上广泛用于急性支气管炎的治疗[3]。临床研究表明加用麻杏石甘汤治疗急性支气管炎在炎症指标恢复时间、退热时间、咳嗽时间、肺部啰音消失时间及总有效率等方面都优于单纯的西医治疗[4,5]。

为探讨麻杏石甘汤治疗急性支气管炎的机制，本文将基于网络药理学的技术，构建麻杏石甘汤治疗急性支气管炎的“药物-成分-靶点-疾病”网络图，利用KEGG分析和GO分析确定其活性通路和活性基因。利用分子对接技术研究麻杏石甘汤的关键成分与关键靶点之间的相互作用，并利用基因注释验证上述关键靶点，以期为进一步实验研究、临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 化学成分的获取与活性成分的筛选

从中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)检索甘草、麻黄、苦杏仁和石膏的成分。根据口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类 药 性(drug-likeness，DL)≥0.18初步筛选出活性成分。在TCMSP数据库中获取活性成分相应的蛋白靶点，并删除不含有靶点的成分。通过STRING(https://string-db.org/)数据库将收集到的蛋白靶点转化为对应的基因名称(gene symbol)，其中物种来源选择人源性(Homo sapiens)。

1.2 筛选麻杏石甘汤治疗急性支气管炎的潜在靶点

通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，以“acute bronchitis”作为关键词检索疾病相关靶点，获取急性支气管炎相关的疾病靶点。利用在线网站Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)将疾病靶点与“1.1”中获得的成分靶点取交集，最终获得麻杏石甘汤治疗急性支气管炎的候选靶点。

1.3 靶点蛋白相互作用(PPI)网络的构建

将1.2中的候选靶点上传至STRING数据库，选择物种为“homo sapiens”，置信度设置为0.4，对筛选出的候选靶点进行蛋白互作关系分析。网络中节点(nodes)代表靶蛋白，边(edges)代表靶蛋白之间的互相作用，度值(degree)代表网络中节点与其他节点的连接数量，度值越高表示该节点在网络中越重要。构建PPI网络后，将文件导入Cytoscape(3.6.0)软件，并利用Cytohubba插件对网络进行关键靶点分析，按照degree排名，排名前五位的可认为是麻杏石甘汤治疗急性支气管炎的关键靶点。

1.4 药物-成分-靶点-疾病网络的构建

使用Cytoscape构建麻杏石甘汤治疗急性支气管炎的“药物-成分-靶点-疾病”网络，同时采用Cytohubba插件对其进行关键成分分析。按照degree排名，排名前五位的可认为是麻杏石甘汤治疗急性支气管炎的关键成分。

1.5 生物过程分析

将筛选出的潜在靶点，利用Metascape(http://metascape.org/)数据库，对麻杏石甘汤治疗急性支气管炎的靶点进行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析与GO生物学过程分析。利用Omicshare(https://www.omicshare.com/)在线绘图网站绘制KEGG信号通路中排名前20的气泡图。

1.6 靶点-信号通路网络图的构建

利用Cytoscape软件构建KEGG信号通路中排名前20的靶点-通路网络图。

1.7 分子对接

利用Autodock4.2.6、AutodockTools1.5.6、pymol2.5和python2.5软件对1.3得到的关键靶点及1.4得到的关键成分进行半柔性对接。结合能小于0kJ·mol-1 则表明有自发结合的可能。

1.8 关键靶点的基因注释

利用KEGG(https://www.kegg.jp/)网络数据库中KEGG Mapper功能，将PPI网络中degree值排名最高的5个关键靶点在信号通路图中标注出来，验证麻杏石甘汤治疗急性支气管炎的主要信号通路。

2 结果

2.1 活性成分的筛选结果

从TCMSP数据库中找到麻杏石甘汤中4味中药的成分，并根据OB≥30%，DL≥0.18进一步筛选、去重后共得到候选成分123个。将候选成分在TCMSP数据库中获取其相应的蛋白靶点信息，通过STRING数据库将蛋白靶点转换为基因名称，剔除重复后共获得238个潜在基因靶点(表1)。

表1 麻杏石甘汤候选成分的具体信息

2.2 潜在靶点筛选结果

在GeneCards数据库中找到急性支气管炎相关靶点共1629个，将疾病相关靶点与麻杏石甘汤的成分靶点分别输入韦恩图在线绘制网站(Venny)中，绘制维恩图，图1。合并后共得到129个潜在靶点。

图1 药物-疾病靶点维恩分析图

2.3 关键靶点的PPI网络图

利用STRING数据库和Cytoscape软件，对麻杏石甘汤治疗急性支气管炎的129个潜在靶点进行PPI分析。结果显示129个节点共有2675条边，degree值排名前五的靶点依次为：AKT1，TP53，IL6，CASP3，VEGFA。这5个靶点可认为是麻杏石甘汤治疗AB的关键靶点(图2)。

图2 关键靶点PPI网络图

2.4 药物-成分-靶点-疾病网络图构建

利用Cytoscape软件建立药物-成分-靶点-疾病的可视化网络图，见图3。利用CytoHubba插件分析，按degree值筛选出排名前五的活性成分，依次为槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)、柚皮素(Naringenin)、光甘草定(Glabridin)。网络图结果显示麻杏石甘汤为多成分、多靶点治疗急性支气管炎的作用机制。

图3 药物-成分-靶点-疾病网络图

2.5 KEGG通路富集和GO分类富集分析结果

利用Metascape数据库，以最小计数为3、P<0.01、富集因子>1.5为筛选条件，对筛选出来的129个潜在靶点(选择H.sapiens)，进行KEGG通路富集分析和GO分类富集分析。

KEGG通路富集分析共获得280条通路，对KEGG分析结果的前20条通路通过Omicshare在线网站进行可视化处理，得到高级气泡图。其中气泡面积大小代表基因数量，气泡颜色代表P值的大小，即富集显著性，见图4。筛选出的信号通路与疾病相关的主要有：PI3K/AKT信号通路、IL-17信号通路 、细胞老化、叉头框转录因子O信号通路、松弛素信号通路、NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路、程序性坏死、长寿调节途径、钙信号通路、线粒体和产生IgA的肠道免疫网络。

图4 KEGG通路富集分析(上部分气泡图，下部分柱状图)

GO生物过程功能富集分析共获得429个条目，见图5。其中生物过程(biological process)251个，涉及对有毒物质的反应、对无机物的反应和凋亡信号通路等；分子功能(molecular function)92个，涉及蛋白激酶结合、蛋白质均二聚活性和转录因子结合等；细胞组分(cellular component)86 个，涉及膜筏、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物和转录因子复合体等。

图5 GO分析图(由上至下分别为：GO-BP，GO-CC，GO-MF)

2.6 靶点-信号通路网络图的构建

为进一步直观的显示麻杏石甘汤治疗急性支气管炎涉及KEGG通路及靶点的关系，使用Cytoscape构建了“靶点-信号通路”的网络图，见图6。该通路图中共有90个节点，189条边，平均度值为4.2。KEGG通路中PI3K/AKT信号通路度值最高，为35，其次为IL-17信号通路、细胞老化、叉头框转录因子O信号通路等。

图6 麻杏石甘汤治疗AB“靶点-信号通路”网络图

2.7 分子对接

利用Autodock对配体和受体进行半柔性对接，结果显示quercetin，Kaempferol，Luteolin，Naringenin，Glabridin等5个关键成分与AKT1，TP53，IL-6，CASP3，VEGFA等5个关键靶点之间均有较强的结合能力。结合能(binding energy)<-5 kcal·mol-1的 有24对，<-7.0 kcal·mol-1的 有4对，其 中ATK1- Glabridin的结合能最低，为-8.95 kcal·mol-1，具体对接结果见表2。

表2 核心成分与核心靶点对接结果

2.8 关键靶点的基因注释结果

利用KEGG数据库的KEGG Mapper功能将5个关键靶点，在PI3K/AKT信号通路中用红色标注出来，结果显示有4个靶点参与PI3K/AKT信号通路的相关调控，结果见图7。

图7 麻杏石甘汤调控急性支气管炎信号通路靶点(红色标记)

3 讨论

本研究通过网络药理学的方法，构建药物-成分-靶点-疾病网络图，表明了麻杏石甘汤多成分、多靶点、多信号通路协同发挥作用的特点。其关键成分很可能为槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、光甘草定。药理作用研究显示槲皮素，山奈酚具有改善气道炎症、抗病毒及防止咳嗽的作用[6-8]。木犀草素对支气管炎具有解痉的作用[9]。柚皮素为黄烷酮类化合物，具有抗病毒和抗炎的双重作用[10]。光甘草定为类黄酮化合物，具有多种药理活性，对于气道炎症的药理活性包括抗氧化作用、抗炎作用及改善呼吸功能等[11]。

麻杏石甘汤活性成分治疗急性支气管炎所调控的靶点互作网络表明，关键靶点很可能为AKT1、TP53、IL-6、CASP3、VEGFA。KEGG通路分析和GO分子功能富集分析阐明了麻杏石甘汤多功能、多靶点、多通路治疗的机制，相关的通路有PI3K/AKT信号通路、IL-17信号通路、细胞老化、叉头框转录因子O信号通路、松弛素信号通路、NF-κB信号通路、JAKSTAT信号通路、程序性坏死、长寿调节途径、钙信号通路、线粒体和产生IgA的肠道免疫网络等。结合本研究网络药理学预测的结果及相关文献回顾，麻杏石甘汤治疗急性支气管炎的潜在机制可进一步归纳为以下方面。

3.1 抑制细胞增殖

3.1.1 抑制AKT1蛋白激活

研究表明，PI3K/AKT信号通路及下游信号因子在慢性炎症中炎症介质的表达、活化、炎症细胞募集、免疫细胞功能、气道重塑和皮质类固醇不敏感中起着至关重要的作用。来自动物模型，原代细胞和其他疾病临床研究的数据表明，PI3K/AKT抑制剂可作为潜在的治疗炎症性呼吸系统疾病包括哮喘的新疗法[12]。AKT1是PI3K/AKT信号通路重要的游靶标，可参与生长因子、细胞因子等激活下游靶标的细胞信号传导[13]。AKT1可抑制AKT磷酸化减弱人支气管平滑肌增殖，以减轻气道重塑[14]。分子对接结果显示AKT1蛋白与槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、光甘草定的结合能均小于-5.0 kcal·mol-1，提示AKT1很可能为这五个关键活性成分的靶标之一。槲皮素、木犀草素、柚皮素均有研究表明可抑制PI3K激活而发挥抑制支气管炎症、减轻气道重塑的作用[15-17]。据此，槲皮素、木犀草和柚皮素与AKT1蛋白结合，抑制支气管炎症、减少气道重塑很有可能是麻杏石甘汤治疗急性支气管炎的机制之一。

3.1.2 抑制IL-6生成

IL-6是炎症反应的重要因子之一，有研究表明IL-6在人体中参与了多种炎症性疾病的发生，属于一种促炎因子[18]。有研究表明，槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素和光甘草定在IL-17信号通路，抑制IL-6的生成、改善上呼吸道感染症状有积极的意义[19,20]。

3.2 调节钙信号通道

气道平滑肌的收缩力增强需要细胞内钙浓度升高，在静息状态下，气道平滑肌细胞维持相对较低的细胞内钙浓度，并通过激动剂对表面受体的激活致使细胞内钙浓度升高，最终导致细胞收缩。促炎因子参与调节细胞内钙调节途径的表达与活性，从而导致气道平滑肌细胞高反应性[21]。有研究表明槲皮素、柚皮素及光甘草定均可抑制细胞因子产生，激活大电导的Ca2+活化的K+通道来松弛气管平滑肌，介导质膜超极化并减少Ca2+流入[22-24]。

3.3 调节线粒体功能

线粒体在Ca2+调节、氧化还原调节和细胞生物学方面具有多种多样但相互联系的作用，对于气道平滑肌的生理变化也起到至关重要的作用。越来越多的研究表明线粒体功能障碍与气道疾病密切相关[25]。槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素和光甘草定均有文献报道能够调节线粒体功能，保护相关的细胞免受氧化应激[26-29]。

急性支气管炎是由感染、物理、化学刺激或过敏等因素引起的急性气管-支气管黏膜炎症，常发生于寒冷季节或气温突然变冷时，药物治疗的原则主要为镇咳、祛痰、解痉抗过敏和抗感染治疗[30]。麻杏石甘汤作为《伤寒论》中的经典方剂，对咳嗽、支气管炎、肺炎等多种肺部疾病均有良好的治疗效果，具有镇咳、祛痰、平喘、解热、抗病毒及免疫调节等多种药理作用，“清”“ 透”结合，宣肺清热[3,31]。本研究初步表明麻杏石甘汤治疗急性支气管炎为多成分、多靶点和多通路的的模式。其潜在的机制为抑制细胞增殖，调节钙信号通道和调节线粒体功能。但尚有部分通路和机制未得到验证，本研究可以为之后进一步的研究提供思路和科学依据。但由于网络药理学和互联网数据有一定的局限性，不能完全表达中医药复方的有效成分及其相关作用机制，由此结合网络药理学的分析结果仍需后续体内外试验的观察与验证[32]。