β-catenin和DKK1在皮肤恶性黑色素瘤中的表达及其 与预后的关系

周雨馨，庞得全，田菲，韩朵，石书玮

(河北省唐山市华北理工大学附属医院，河北 唐山 063000)

0 引言

恶性黑色素瘤发病隐匿，恶性程度高，发生血行转移或淋巴结转移早，预后极差。大量的临床研究资料证实，约占50%的MM最终死于远处转移。据统计，90%的MM发生于周身皮肤。皮肤恶性黑色素瘤(Cutaneous malignant melanoma，CMM)是一种神经嵴黑色素细胞来源的恶性肿瘤，是致死性最大的皮肤肿瘤[1]。目前，对于早期的恶性黑色素瘤多采用手术切除，术后根据其病情发展可选择放、化疗，但该疾病早期转移率高，单纯放、化疗敏感性较差，疗效一般。随着对黑色素瘤分子生物学的深入研究，黑色素瘤转化的主要细胞通路在于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径、磷酸酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路、酪氨酸激酶受体(TKR)途径等，科学家们针对黑色素瘤的不同作用靶点研制出一系列抗肿瘤药物用于其治疗[2]。时至今日，靶向药物已进入临床应用，而针对 β-catenin及DKK1基因的研究仍处于机制探索阶段，两者在 CMM中的联合研究在文献中少有报道。因此，本研究就天津医科大学附属肿瘤医院五年的 MM 收治情况和预后相关因素进行分析探讨，然后进一步探索β-catenin、DKK1在皮肤恶性黑色素瘤中的表达情况及与预后的关系，为进一步认识 CMM 的预后因素、探讨基于分子水平的发病机制、协同机制和促进分子靶向药物研发等起到一定的促进作用。

1 资料与方法

1.1 患者资料

回顾性分析2005年1月至2009年12月在在天津医科大学附属肿瘤医院确诊并治疗的190例MM患者病历资料。从中筛选出经组织病理学确诊为CMM且术前均未有手术治疗、化学治疗、放射治疗和免疫治疗史的患者共30例。(1)初选切片：随机收集病例库中CMM病理切片30例纳入CMM组，瘤周相应正常皮肤组织30例作为对照组。(2)排除标准：结合HE和免疫组织化学染色情况，剔除切片中无瘤组织、破碎瘤组织、CMM转移淋巴结组织、染色过程中脱片等无效切片，剔除病历随访中死于其他疾病的无效切片。

1.2 染色

对所选切片进行HE染色和免疫组化SP两步染色法。

1.3 判定

β-catenin采用半定量检测法[4]，DKK1采用Volm双评分法[5]。根据阳性细胞在全部癌细胞中所占比例以及阳性细胞染色强度判定实验结果：

DKK1基因表达在免疫组织化学染色中主要以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性判定标准，β-catenin基因表达在免疫组织化学染色中主要以细胞浆或细胞核出现棕黄色颗粒为阳性判定标准。首先根据着色的程度将表达强度分为：0分：无着色；1分：浅黄色：2分：棕黄色；3分：棕褐色。根据着色的细胞比例分别分为：DKK1：1分：≤25%；25%<2分≤50%；3分：>50%。β-catenin：0分：无阳性；1分：<10%；10≤2分≤50%；3分：>50%。β-catenin的表达情况以着色程度值与着色细胞比例值的乘积为结果，0分为阴性，≥1分为阳性；DKK1的表达以着色程度值与着色细胞比例值之和作为最终结果。

1.4 统计学方法

首先对全部 30 例患者进行一般情况分析，然后对纳入统计分析的各组患者进一步分析：Chi-Square Test 进行 CMM 组和对照组间基因表达差异分析，Spearman秩相关进行各基因之间及各基因与淋巴结转移之间的相关性分析，Kaplan-Meier法Log-Rank 检验进行基因表达的单因素生存分析，均以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

回顾性分析5年来天津医科大学附属肿瘤医院纳入统计分析的190例患者中总中位生存时间为43.1个月。30名CMM患者的一般特征见表1。男女比1.14∶1。初诊年龄40～90岁，中位发病年龄56岁。50岁以后发病居多，超过65岁的患者约占30%。发病部位以肢端(手足部)居多。

表1 30 例 CMM 患者的一般特征(n,%)

2.2 表达情况

(1)CMM组中β-catenin阳性表达15例，阳性率68.2%；对照组中阳性表达4例，阳性率18.2%，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。(2)CMM组中DKK1阳性表达17例，阳性率68.0%；对照组中阳性表达5例，阳性率20.0%，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 β-catenin、DKK1 在 CMM 组和对照组中的表达情况比较(n,%)

2.3 关系分析

(1)与CMM预后的关系分析：CMM组中β-catenin阳性表达15例，阳性率68.2%。单因素生存分析显示β-catenin的表达可影响CMM的预后(P<0.05)；CMM组中DKK1阳性表达17例，阳性率68.0%。单因素生存分析显示DKK1的表达不是CMM的预后影响因素(P>0.05)，详见表3。(2)与淋巴结转移的关系分析：CMM组(β-catenin切片组)中有淋巴结转移10例，其中9例β-catenin表达阳性，阳性率90.0%；无淋巴结转移12例，其中有6例β-catenin表达阳性，阳性率为50.0%；差异具有统计学意义，呈正相关(r=0.428，P<0.05)；CMM组(DKK1切片组)中有淋巴结转移9例，全部9例DKK1的表达均为阳性，阳性率100%；无淋巴结转移16例，其中8例DKK1表达阳性，阳性率50.0%；差异具有统计学意义，呈正相关(r=0.514，P<0.05)。详见表4。

表3 β-catenin、DKK1 的表达差异与CMM 的预后关系

表4 β-catenin、DKK1 的表达差异与淋巴结转移的相关性分析(n,%)

2.4 β-catenin、DKK1的表达之间的相关性分析

CMM组β-catenin表达阳性的14例切片中，有10例DKK1也表达阳性。β-catenin表达阴性的7例切片中，有1例DKK1也表达阴性。β-catenin与DKK1的表达一致性52.4%(11/21)，差异无统计学意义(r=-0.158，P>0.05)，详见表5。

表5 β-catenin 与DKK1 表达之间的相关性分析

3 讨论

恶性黑色素瘤恶性程度极高，在疾病早期容易发生淋巴结及血行转移，临床预后差，晚期患者中位生存期仅为7.5个月，2年生存率约为15%，5年生存率仅为5%[4]。黑色素瘤由神经鞘细胞癌变发展而来，而神经鞘细胞来源于外胚层，因此恶性黑色素瘤主要发生于皮肤[5]。对于晚期恶性黑色素瘤，50%～80%的患者可出现肝转移，8%～46%的患者可出现脑转移[6]。与很多恶性肿瘤一样，部分早期MM患者可通过手术得到根治，化疗、放疗及生物治疗都是中晚期MM患者的传统治疗手段，但MM对上述治疗措施均不敏感。而随着对黑色素瘤机制研究的不断深入及现代生物技术的不断发展，肿瘤免疫治疗为改善患者预后带来新希望[7]。学者们在恶性肿瘤中研究的最多是Wnt/β-catenin信号通路，常被称为经典Wnt信号通路[8]。持续异常激活经典Wnt信号通路时可通过增加β-catenin下游靶基因的表达实现增加血供、抑制凋亡、加速增殖、促进转移的恶性结果，肿瘤易感性大大增加。DKK1在恶性肿瘤中的研究非常少，目前被认为是经典Wnt信号通路的传统抑制剂。分子靶向药物逐渐正承担起愈发重要的角色。

β-连环蛋白(β-catenin)由β连环蛋白1(cateninbeta1，CTNNB1)基因编码，是一种高保守的多功能分泌型蛋白，参与构成WNT/β-catenin信号通路发挥作用[11]。β-catenin是WNT/β-catenin重要的节点，可通过与钙黏蛋白作用参与细胞间黏附。研究表明β-catenin表达可下调钙黏蛋白水平，因此β-catenin异常表达会造成细胞间黏附作用减小、松散，进而提高肿瘤转移风险[9]。本研究发现，CMM组织中β-catenin阳性表达率明显高于癌旁组织，β-catenin表达与TNM分期、肿瘤直径、淋巴结转移均呈正相关，正常细胞间黏附作用较强，从而实现信息交流和物质交换，而肿瘤细胞则相反，通过减弱细胞间黏附作用实现细胞脱落，然后发生恶性增殖和转移，可能原因是β-catenin过表达会降低钙黏蛋白水平，从而降低细胞间黏附作用，增加肿瘤细胞脱落和转移风险。这与张攀[10]等研究结果一致。此外β-catenin高表达会使WNT/β-catenin通路持续处于激活状态，使通路中下游分子突变，促进肿瘤发生发展，因此恶性程度高、相对较大的肿瘤更易发生淋巴结转移[11]。

作为Wnt/β-catenin信号通路中重要一环的DKK1，曾被作为经典抑制剂进行各种肿瘤的基础研究，但现在越来越多的学者发现DKK1在不同研究条件下呈现出截然不同的结果。DKK1至少有两种方式可关闭经典Wnt信号通路[12]，一是Frizzled相关蛋白质，通过竞争性抑制Frizzled与Wnt的结合；另一个就是DKK1，可与细胞膜上的Wnt受体LRP5/6、共受体Kremen1/2结合，形成聚合物后内吞，关闭Wnt信号，终止靶基因异常转录进程。此外，DKK1是经典Wnt信号通路的靶基因，其启动子区域有β-catenin结合位点，部分研究认为转录生成的DKK1可以通过负反馈抑制上游基因的表达[13]，与信号链上其他因子共同维持着内环境的稳态。关于DKK1在恶性肿瘤中的表达，研究者其实早已发现有多样化的特点。在肝细胞癌、肝/肾母细胞瘤、NSCLC、多发性骨髓瘤等肿瘤中DKK1多表达增高，呈现促癌基因的特征，而在CMM、胃癌中，据报道DKK1表达降低，呈现抑癌基因的特征。有学者通过细胞实验发现[14]，黑色素细胞中高表达的DKK1与CMM组织中的低表达形成鲜明对比，通过si-RNA沉默黑色素细胞中的DKK1后，则黑色素细胞呈现高比例快速增殖能力。用Ad-DKK1腺病毒载体高效感染黑色素瘤A375细胞后[15]，高表达的DKK1明显抑制了β-catenin的表达水平，而β-catenin的这一低水平表达在干扰DKK1的表达后明显增高，从而推测β-catenin的表达下调受DKK1的影响，后者可抑制经典Wnt信号通路的传导，发挥对肿瘤进程的抑制作用。本研究中，DKK1在CMM组中多呈阳性表达，差异具有统计学意义，与上述学者的结论相反。我们基于本研究结论展望：DKK1的表达差异是否因人种而异；大样本数据中DKK1与淋巴结转移及CMM预后的相关关系如何；DKK1作为传统Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂为什么在一些研究中未发挥抑制剂的作用，除了已发现的β-catenin基因变异，是否存在或存在什么样的干扰因素，我们的研究样本中是否存在有统计意义的β-catenin基因变异？未来需扩大样本量、多区域、多种族、对临床病理因素细分后进一步研究。