基于谷氨酸脱羧酶65的口服疫苗对链脲佐菌素诱导的1型糖尿病小鼠的治疗作用

吴伊玲，尤 琪，吴 洁

（中国药科大学生命科学与技术学院，南京 211198）

1型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）是一种自身免疫性疾病，表现为机体对胰腺抗原成分免疫欠耐受，自身反应性T细胞对胰腺β细胞产生免疫性破坏，导致胰岛素分泌绝对不足［1-2］。一旦发病，患者需要终身使用外源胰岛素并定期监测血糖水平。重建机体对自身抗原的免疫耐受是研制相关疫苗防治T1D的关键。

在疫苗开发方面，抗原表位的选择十分重要，需要选择相关抗原分子上合适的抗原肽。谷氨酸脱羧酶65（glutamic acid decarboxylase 65，GAD65）为T1D自身抗原，谷氨酸脱羧酶抗体（GADA）是T1D最早出现且阳性率最高的自身抗体，是非肥胖性糖尿病（NOD）小鼠由外周胰腺炎发展为内部浸润的关键靶点［3］。给雌性NOD小鼠注射外源性GAD65，可以明显降低其T1D发病率［4］。GAD65敲除的NOD小鼠发生T1D的概率显著降低且发病时间明显推后［5］。临床研究显示，GAD65明矾制剂（或联合维生素D）免疫可以维持患者β细胞功能，改善T1D的临床指标［6-7］。

实验室前期选择GAD65中与疾病发生相关的关键表位肽段（p217~236，p524~538，p290~306）形成的靶抗原组合肽GADIII作为分子组分，使用霍乱毒素B亚基（cholera toxin subunit B，CTB）作为佐剂分子，成功构建得到原核表达重组菌株E.coliBL21-pET28a：CTB-GADIII［8］，诱 导 表 达 获得的融合蛋白CTB-GADIII滴鼻免疫NOD小鼠可以显著降低T1D发病率。

临床上疫苗的给药方式大多为注射，其次为滴鼻，而口服制剂由于胃肠道复杂的生理环境限制了其开发，但近年来也有很多成功的尝试和报道［9-10］。

海藻酸钠（sodiumalginate，SA）分子中含有大量的羧基，具有一定的生物黏附性，属于黏膜黏附性纳米材料，能够保护多肽蛋白不受胃酸的破坏。此外，制备成的纳米粒能够持续缓慢地在肠黏膜部位释放，通过M细胞将树突延伸至腔内捕获抗原［11］，这为药物或疫苗的靶向输送提供了可能性。本研究尝试应用海藻酸盐作为载体制备口服纳米疫苗制剂，靶向肠道进行免疫诱导，进而防治T1D。参考相关研究［12］，使用溶剂扩散法制备了GADIII-海藻酸钙纳米粒（Ca-Alg-GADIII）。以多次小剂量腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导的T1D小鼠模型为研究对象，考察口服疫苗Ca-Alg-GADIII对T1D小鼠的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料

1.1 药品与试剂

STZ（美国Sigma公司）；抗小鼠胰岛素抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；小鼠ELISA试剂盒（GADA、GADA-IgG1、GADA-IgG2a、GADA-IgG2b、IL-4、IFN-γ、TGF-β1，上海通蔚生物科技有限公司）；流 式 抗 体（FITC-CD4、PE-CD25、PE-Cy7-RoRγt、Percp-Foxp3、APC-GATA3、PE-T-bet，美 国Biolegend公司）；破膜固定剂（美国BD公司）；红细胞裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪 器

5D-1型血糖仪（台湾博仕珑公司）；Spark多功能微孔板检测仪（瑞士Tecan公司）；流式细胞仪AccuriTM C6 FCM（美国BD公司）；Zetasizer Nano粒度电位仪（马尔文仪器公司）。

1.3 菌 种

诱导型表达菌株E.coliBL21-pET28a：CTBGADIII，具有卡那霉素抗性，本实验室保存。

1.4 动 物

SPF级C57BL/6小鼠，雄性，4~5周龄，购自浙江省医学科学院，合格证号：20200610Abzz0118000 762。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方法

2.1 融合蛋白CTB-GADIII的纯化及Ca-Alg-GADIII的制备

GADIII融合蛋白的纯化［8］及海藻酸钙纳米粒的制备［12］分别参考相关文献进行。

2.2 T1D小鼠模型的建立及动物免疫

4~5周龄的C57BL/6小鼠适应1周后，禁食14 h，按50 mg/kg的剂量腹腔注射STZ 0.1 mL，每天1次，连续5 d。连续14 d监测血糖，以空腹血糖≥11.1 mmol/L为造模成功标准，选取造模成功小鼠，随机分成4组：模型组、空载体对照组（Vehicle组），融合蛋白CTB-GADIII低剂量组（20µg），融合蛋白CTB-GADIII高剂量组（100µg），一周给药1次，共5次。

2.3 血糖、体重、糖耐量检测

自造模起使用血糖仪动态监测各只小鼠的尾静脉血糖水平，同时记录相应时间点的各只小鼠的准确体重。

给药结束后，各组选取5~6只小鼠用于葡萄糖耐量试验。小鼠禁食过夜，期间自由饮水。次日测定小鼠基础血糖，之后立即灌胃新鲜配制的葡萄糖生理盐水溶液，按照每20 g体重灌胃40 mg葡萄糖的量，分别经口给予葡萄糖，0，15，30，60，90，120 min测定小鼠尾静脉血糖，观察血糖变化趋势。

2.4 胰腺病理切片的制作及免疫组化分析

给药结束后，每组分别选取3只小鼠，无菌条件下取胰腺组织，于组织固定液中固定24 h。胰腺切片制作、HE染色及免疫组化均由中国药科大学病理与PDX药效评价平台完成。

选取3~4张小鼠胰腺切片进行HE染色，对整个切片进行全视野扫描，记录整个切片中胰岛数目及其病理情况。

小鼠胰腺切片用胰岛素抗体染色，检测胰岛素分泌情况。将制备好的不同组别小鼠胰腺切片（每组3只小鼠，每只3~4张切片）进行全视野扫描，每张切片随机选择截取5个视野，通过Image Pro Plus圈出各个视野图片中胰岛素阳性染色区域，以正常组对应像素点为对照，计算出各组胰岛素阳性面积。

2.5 血清中相关自身抗体及细胞因子的检测

每两周对小鼠进行一次眼眶取血，于4 000 r/min条件下离心5 min取上清液，所得血清于-80℃条件下冷冻保存。具体实验步骤按照试剂盒说明书要求进行。

2.6 流式细胞术检测T1D小鼠外周免疫器官CD4+T细胞

给药结束后，每组分别取3只小鼠处死，无菌条件下取出小鼠脾脏，肠系膜淋巴结（MLN）和胰腺淋巴结（PLN）浸泡于含胎牛血清（FBS）的缓冲液（PBS+1% FBS）的平皿中，于200目筛网上研磨，收集细胞悬液，加入总体积1/3的红细胞裂解液裂解红细胞。离心后加入含FBS的缓冲液洗涤并计数，调整各管细胞浓度，并进行表面染色，相应抗体：CD4-FITC（0.5µL）和CD25-PE（0.5µL），4℃下避光孵育40 min。用含FBS的缓冲液清洗后加入破膜液，4℃避光孵育40 min。进行核内转录因子特异性染色，相应抗体：Foxp3-APC/T-bet-PE（0.5µL）和RoRγt-APC/GATA3-APC（1µL）。4℃下避光孵育30 min。加入含FBS的缓冲液，过200目筛网，转移至流式管后使用流式细胞仪检测，实验数据采用Flowjo软件进行分析。

2.7 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件对实验数据进行统计学分析。计量资料以±s,表示。如无特殊说明所有显著性均采用独立样本t检验分析组间差异，P<0.05表示组间差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 融合蛋白CTB-GADIII的纯化及Ca-Alg-GADIII的制备

通过对工程菌E.coliBL21-pET28a：CTB-GADIII的培养、乳糖诱导及使用阳离子交换树脂，诱导表达并纯化了融合蛋白CTB-GADIII。如图1所示，12%SDS-PAGE电泳显示无明显其他杂蛋白条带，使用Image J图像处理软件计算目的蛋白条带灰度与泳道总蛋白灰度比值，分析可得蛋白纯度约为96%。非还原条件下可以看到复性后的冻干蛋白溶液在约35、50 kD处有条带，由于CTB易形成五聚体结构，目的蛋白主要为非共价结合形成的多聚体，电泳过程中容易被SDS解离成单一亚基，所以在单体相对分子质量17 kD处条带更浓。

Figure 1 Renaturation of fusion protein CTB-GADIII（cholera toxin subunit B-glutamic acid decarboxylase）

通过溶剂扩散法，成功制备了Ca-Alg-GADIII。经检测，Ca-Alg-GADIII的Zeta电位为-67 mV，说明融合蛋白CTB-GADIII已经被成功包被形成纳米制剂。Ca-Alg-GADIII的粒径约为277 nm，符合纳米粒的粒径范围。

3.2 T1D小鼠血糖、体重监测及糖耐量测定

给药结束后，对不同组别小鼠进行血糖检测，如图2所示：给药组小鼠血糖有明显改善（图2-A），部分小鼠血糖恢复正常。同时，通过比较给药前后不同组别小鼠体重（图2-B左侧），发现每组小鼠体重都有不同程度的增长，但高剂量疫苗组小鼠的体重的增长率明显大于模型组及空载体对照组（图2-B右侧，P<0.01）。结果表明：口服疫苗有助于改善T1D小鼠的血糖，同时高剂量疫苗免疫有利于小鼠体重的增加。

给药结束后，通过OGTT检测T1D小鼠的葡萄糖代谢能力。结果如图2-C所示，各组小鼠血糖都呈现先升后降的趋势。通过计算曲线下面积（AUC）发现，高剂量疫苗组小鼠的AUC与空载体对照组（P<0.05）和模型组（P<0.01）存在显著差异，说明高剂量疫苗免疫可以明显提高T1D小鼠葡萄糖耐量。

Figure 2 Ca-Alg-GADIII play a therapeutic effect on T1D mice(±s,,n=4-8)

3.3 T1D小鼠胰腺HE染色及免疫组化

HE染色结果及免疫组化结果如图3-A，B所示，免疫结束后，正常组小鼠胰岛多为圆形和椭圆形，胰岛面积较大，界限清楚；空载体对照组小鼠胰岛面积明显缩小，形态不规则，分布稀疏。疫苗组小鼠胰腺组织相较于空载体对照组病理情况有所改善。

通过对切片的观察，发现给药与否，不同组别小鼠胰岛个数及面积存在明显差异，因此按“2.4”项下方法将图像数据化。结果如图3-C所示，免疫结束后，高剂量疫苗组小鼠的胰岛个数相较于低剂量疫苗组略高，二者显著优于空载体对照组（P<0.05），而空载体对照组小鼠胰岛个数明显小于正常组（P<0.001）。胰岛素免疫组化分析结果表明（图3-D）：疫苗免疫后小鼠胰腺中胰岛素阳性面积较空载体对照组明显升高（P<0.05）。结果表明：Ca-Alg-GADIII可以降低发病过程中的胰腺损伤，促进胰岛素分泌，保护T1D小鼠残存胰岛的功能。

3.4 T1D小鼠血清相关抗体及细胞因子的检测

血清中T1D相关自身抗体检测结果如图4所示：与空载体对照组和低剂量疫苗组相比，高剂量疫苗组小鼠血清中GADA含量明显降低（P<0.05），说明Ca-Alg-GADIII能够诱发T1D小鼠重建特异性的体液免疫耐受（图4-A）。进一步对GADA的抗体分型进行分析，相比于空载体对照组和低剂量疫苗组，高剂量疫苗组小鼠血清中GADAIgG1的含量明显下降（图4-B），且与空载体对照组相比，GADA-IgG2a的含量显著降低（图4-C，P<0.01）。3组小鼠血清中GADA-IgG2b（图4-D）含量均无差异。临床实验中常用IgG1/IgG2a的变化来判断疫苗诱导免疫应答的类型，如图4-E所示，给药组小鼠血清中IgG1/IgG2a的比值均显著提高（P<0.05）。此外，本研究检测了血清中抗胰岛素抗体，考察免疫后是否发生了扩展耐受。如图4-F所示：与空载体对照组相比，高剂量疫苗组抗胰岛素抗体明显下降（P<0.05），低剂量疫苗组也有所下降。

Figure 3 Ca-Alg-GADIII can sustain islet function of T1D mice(±s,,n=3-6)

Figure 4 Ca-Alg-GADIII modulate the serum level of autoantibodies in T1D mice(±s,,n=4-6)

小鼠血清中相关细胞因子的含量如图5所示：相较于空载体对照组，疫苗免疫组IL-4的含量未出现显著变化，高剂量疫苗组小鼠血清中IFN-γ的含量明显下降（P<0.05），而TGF-β1（主要由Treg细胞产生）明显上升（P<0.05）。

Figure 5 Ca-Alg-GADIII modulate the serum cytokine content of T1D mice(±s,,n=5-6)

3.5 流式检测T1D小鼠MLN、PLN免疫平衡

Figure 6 Ca-Alg-GADIII improves immunomodulatory balance of Th1 and Th2 in the mesenteric lymph node(MLN)of T1D mice(±s,,n=3)

在免疫耐受诱导的实验中，Th1/Th2，Th17/Treg被视为反应机体免疫与炎症状态变化的重要指标。本研究利用流式细胞术对3组小鼠MLN、PLN中Th细胞的几种亚型比例进行了分析，实验结果如图6和图7所示：5次免疫后，相较于空载体对照组，高剂量疫苗免疫小鼠MLN中促炎性Th1细胞及Th1/Th2的比例明显降低（P<0.05）。PLN中呈现相似的结果，相较于空载体对照组和低剂量蛋白组，高剂量疫苗组小鼠的促炎性Th1细胞比例（图7-C，P<0.05）及Th1/Th2的比例（图7-E，P<0.05）也明显降低，Th2细胞没有明显变化。不过各组小鼠MLN和PLN中Th17/Treg数值差别不大（结果未显示）。实验结果表明：Ca-Alg-GADIII口服疫苗主要是通过抑制Th1型细胞分化、调控细胞免疫平衡介导免疫保护作用。

Figure 7 Ca-Alg-GADIII improves immunomodulatory balance of Th1 and Th2 in the pancreatic lymph node(PLN)of T1D mice(±s,,n=3)

4 讨论

疫苗免疫结果显示Ca-Alg-GADIII能缓解T1D小鼠的疾病进程，能改善胰腺组织的病理情况，保护胰岛β细胞的功能，具有一定的治疗作用。

正常个体中，Th1、Th2型细胞处于相对平衡状态，但T1D个体中，内源性的Th1型细胞因子占据主导地位［13-14］，导致大量自身反应性T淋巴细胞浸润胰岛破坏β细胞。其中Th1与Th17可产生多种炎性细胞因子，也是T1D的刺激因素［15-16］；而Th2细胞可抑制Th1分化［17］，Treg细胞与Th17相互拮抗，也可抑制自身反应性T细胞对胰岛的攻击［18］。它们之间的平衡是维持机体炎症与抗炎以及免疫平衡的重要因素［19］。Ca-Alg-GADIII疫苗免疫后小鼠体内自免疫攻击相关的Th1被抑制，Th1/Th2的比例降低，同时相关的自身抗体水平下降，显示口服疫苗能调节T1D小鼠体内的细胞及体液免疫平衡，从而缓解并逆转了胰岛炎症及胰岛β细胞的损伤。

虽然疫苗的剂量和免疫方案还有待优化，但本研究证明了以T1D自身抗原为基础制备的疫苗可以通过肠道黏膜免疫的方式发挥作用，同时也验证了海藻酸钙作为一种安全有效的口服疫苗载体，克服了蛋白药物在胃肠道不稳定的缺点，可用于蛋白疫苗的肠黏膜免疫。