TM9SF2促进三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖与转移

2021-11-07王丽新姜修博郭巧珍王籽橙王玉霞瞿文生段小涛

中国药科大学学报 2021年5期

王丽新，姜修博，郭巧珍，王籽橙，王勃，王玉霞，瞿文生*，段小涛**

（1天津大学化工学院，天津 300350；2军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850；3南京工业大学生物与制药工程学院，南京 211800）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在我国占比恶性肿瘤的7%～10%，并呈逐年上升趋势。到2020年，乳腺癌的新增病例数达到了270万［1］。乳腺癌主要分为三阴型、HER2/neu阳性、Luminal A和Luminal B 4种亚型［2］。乳腺癌的转移是导致患者预后不良的重要因素。现在已知的乳腺癌转移类型有如下3种：局部扩展、淋巴转移、血运转移。目前针对转移并无特效治疗手段，因此，寻找新的控制乳腺癌转移的关键基因，掌握特定蛋白在乳腺癌转移中的作用机制，明确转移相关的分子靶标，对于乳腺癌临床治疗具有重要意义。

9次跨膜超家族蛋白2（transmembrane 9 superfamily protein member 2，TM9SF2）具有9个跨膜结构域，在整个进化过程中保守［3-4］，研究表明TM9蛋白可能在吞噬、黏附和营养吸收中发挥关键作用［5-7］，其中TM9SF1的表达与膀胱癌呈正相关［8］，TM9SF4的过表达与肿瘤转移表型正相关［9-11］。TM9SF2在各种分型的乳腺癌（MCF-7、T-47D、SKBR-3、ZR-75-1、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDAMB-134）细胞系中均有表达，而在正常细胞中表达量较低［12］。通过对肿瘤基因组图谱数据（TCGA）进行分析，约35%的大肠癌患者TM9SF2的mRNA水平升高［13］。另有研究发现，长的基因间非编码RNA 01232（LINC01232）通过调节TM9SF2在胰腺癌中发挥致癌活性［14］。通过乳腺癌整合数据分析平台（breast cancer integrative platform，BCIP）分析TM9SF2 mRNA的表达水平在癌旁组织和乳腺癌组织中的差异，结果发现TM9SF2的mRNA水平在肿瘤细胞中的表达量比在正常细胞中高［15］。本研究对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞株中TM9SF2的蛋白表达水平进行检测，并通过靶向沉默TM9SF2，探究TM9SF2对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖和转移能力的影响，并进一步探讨了TM9SF2调控三阴性乳腺癌的分子机制。

1 材料

1.1 试剂

DMEM培养基（德国Sigma公司）；胎牛血清、胰酶、磷酸盐缓冲液（PBS）（美国Gibco公司）；Lipofectamine-iMAX（美国Invitrogen公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF）、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂（Phostop）（美国Selleck公司）；Bradford蛋白定量试剂盒（美国Thermo公司）；兔抗人TM9SF2（美国Abcam公司）；兔抗人Snail、Slug、N-cadherin、PI3K、p-AKT、ERK、SRC、GAPDH、兔二抗（美国CST公司）、聚偏二氟乙烯膜（PVDF，美国Millipore公司）。

1.2 仪器

酶标仪、细胞培养箱、水平离心机、高速低温离心机（美国Thermo公司）；显微图像采集系统、电泳仪、电转仪（美国Bio-Rad公司）；微量移液器（德国Eppendorf公司）。

1.3 细胞

人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、非致瘤的乳腺上皮细胞株MCF-10A购自美国模式培养物集存库（ATCC），由军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所保存。

2 方法

2.1 siRNA合成

本研究用到的siRNA的核酸序列如表1所示，由广州锐博生物科技有限公司进行设计并合成。

Table 1 siRNA Sequence

2.2 细胞培养

用DMEM完全培养基（含有10%胎牛血清和1%青链霉素）在37℃、5%CO2的培养箱内培养细胞，细胞融合率达90%及以上，用胰蛋白酶消化，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的传代比例一般为1∶3，非致瘤的乳腺上皮细胞株MCF-10A一般按照1∶2的比例传代。

2.3 敲低TM9SF2基因

将MDA-MB-231细胞以每毫升1×105个细胞的密度接种于6孔板，每孔2 mL，置于细胞培养箱中培养12 h，待细胞融合率达35%左右，对MDAMB-231细胞进行转染实验。将转染试剂Lipofectamine-iMAX 4µL与opti-MEM培养基100µL混合，同时将2µmol/L siRNA储存液加入opti-MEM 100µL混合，5 min后，将两者混匀，室温放置15 min后滴加到相应孔板中，培养6 h后换培养液，48 h后可进行后续实验。

2.4 MTS法检测增殖活性

MDA-MB-231细胞经siRNA转染48 h后，进行消化，再用DMEM完全培养基混悬，对每组转染序列的细胞进行计数，并调整每组细胞的浓度为每毫升1×105个细胞，接种到96孔板进行细胞培养，每孔加细胞悬液100µL，摇晃孔板使细胞分布均匀，在37℃、5%CO2条件下进行培养，在接种后的12，24，48，72，96 h，每孔细胞加入MTS溶液20µL，轻晃使其分布均匀，继续37℃孵箱内孵育培养2 h，酶标仪检测570 nm波长处的吸收度，根据吸收度制作细胞的对数期生长曲线。

2.5 Transwell小室侵袭实验检测转移能力

MDA-MB-231细胞经siRNA转染48 h后，进行消化，再用无血清DMEM培养基混悬，对每组转染序列的细胞进行计数，并调整每组细胞的浓度为每毫升2.5×104个细胞，在Transwell小室的下层孔中加入DMEM完全培养基800µL，在上室加入混匀的细胞悬液200µL，置于37℃、5% CO2培养箱中培养36~48 h，用4%多聚甲醛固定20 min，1%结晶紫染色1 h后，用棉签小心擦去膜上面的细胞，在显微镜下观察细胞染色情况，用显微图像采集系统进行拍照。

2.6 划痕愈合迁移实验检测转移能力

siRNA转染MDA-MB-231细胞48 h后，利用10µL枪头在细胞层中形成划痕，生理盐水洗去漂浮细胞，更换无血清培养基，于0 h，24 h在显微镜下观察细胞迁移情况，并随机选取3处进行拍照。每组转染序列设3个复孔。

2.7 Western blot实验检测相关蛋白的表达情况

MDA-MB-231细胞转染48 h后，收集细胞，用RIPA裂解液（含有PMSF、protease inhibitor cocktail、phostop）进行蛋白提取，加上样缓冲液，100℃煮沸15 min，用10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，再转印至PVDF膜上，将PVDF膜放在用TBST配制的含5%脱脂牛奶溶液中室温封闭1 h，再分别加入相应一抗，4℃过夜，次日以TBST洗涤3次，加入二抗，室温孵育1 h，TBST洗涤3次，定影显色，用GAPDH作内参对照，检测不同转染组别的MDAMB-231细胞的蛋白表达情况。

2.8 数据统计

实验数据使用Graph Pad Prism 5统计软件进行统计及图像处理。采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 TM9SF2在MDA-MB-231细胞和MCF-10A细胞的表达量差异

体外培养三阴性细胞株MDA-MB-231以及非致瘤的乳腺上皮细胞株MCF-10A，采用Western blot检测细胞内TM9SF2蛋白表达情况，结果表明TM9SF2在MDA-MB-231中的表达量明显高于MCF-10A（图1）。结果证明，TM9SF2在恶性和转移程度都较高的MDA-MB-231中高表达。

Figure 1 MCF-10A cells had lower expression of TM9SF2 than MDAMB-231 cells

3.2 敲低TM9SF2的效率验证

用siNC、siTM9SF2（1、2、3序列）转染乳腺癌细胞MDA-MB-231，细胞转染48 h后，Western blot检测结果（图2）显示，与对照组相比，转染了siTM9SF2（1、2、3序列）的细胞中TM9SF2的蛋白表达水平明显下调。

Figure 2 Gene silencing efficiency in MDA-MB-231 cells

3.3 敲低TM9SF2对细胞增殖能力的影响

MTS检测结果显示：在细胞贴壁的0、24、48、72和96 h用MTS试剂盒检测细胞增殖活性，敲低TM9SF2的细胞增殖活性明显低于对照组（图3），提示敲低TM9SF2抑制MDA-MB-231的增殖能力。

Figure 3 Effects of silencing the TM9SF2 gene on proliferation of MDA-MB-231 cell lines（±s,,n=3）

3.4 敲低TM9SF2对细胞转移能力的影响

Transwell实验结果显示，敲除TM9SF2的细胞转移数显著减少（图4-A），差异有统计学意义（图4-B）。划痕实验结果显示，与对照组相比，敲低TM9SF2的细胞划痕间隙变化降低（图4-C）。

Figure 4 Effects of silencing TM9SF2 on migration in MDA-MB-231 cell lines

3.5 敲低TM9SF2后相关信号通路的变化

Western blot实验结果显示，与对照组比较，敲低TM9SF2可下调PI3K蛋白表达；并影响AKT蛋白磷酸化激活（图5-A），而对于SRC与ERK通路影响较小。提示TM9SF2主要通过PI3K-AKT通路，调控三阴性乳腺癌的增殖。敲低TM9SF2后Snail、Slug和N-cadherin在蛋白水平表达均出现明显下调（图5-B），这些是EMT通路的重要转录因子和相关蛋白，由此表明敲低TM9SF2影响EMT过程进而影响MDA-MB-231的转移。

4 讨论

本实验通过对高表达TM9SF2的MDA-MB-231细胞进行基因沉默，检测细胞增殖和转移能力的变化，结果表明，TM9SF2在MDA-MB-231细胞中发挥了促进增殖和转移的作用。接下来的实验可以采用Transwell小孔铺人工基底膜胶（Matrigel）进一步检测TM9SF2是否对MDA-MB-231细胞的侵袭产生影响。实验后续通过对其分子机制的研究，发现敲低TM9SF2可下调PI3K的表达，抑制下游AKT磷酸化的发生，但并不显著影响SRC和ERK的表达。PI3K-AKT信号通路在多种细胞功能（例如细胞存活、生长、增殖和代谢）中起着至关重要的作用，在许多人类肿瘤中均被异常激活［16］。TM9SF2特异性通过PI3K-AKT通路影响三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖。由此说明可以通过降低TM9SF2的表达来抑制三阴性乳腺癌的增殖。但是具体通过PI3K-AKT通路的哪个分子对增殖产生影响并未十分明确，而且PI3K-AKT也会对肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等过程产生影响，所以对TM9SF2促进肿瘤增殖的具体分子机制还有待进一步的探究。Western blot实验结果还证明，TM9SF2通过上调EMT通路的重要转录因子Snail、Slug和通路的相关蛋白N-cadherin来增强细胞的转移能力。因此，通过抑制TM9SF2基因发挥生物作用可以减少三阴性乳腺癌细胞进行EMT过程，这一过程可能发生在肿瘤产生早期，因此通过对TM9SF2基因表达的控制有助于患者降低远端转移发生概率，从而提高患者预后的生存质量。