补骨脂素对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的改善作用

张 艳，江振洲*，张陆勇，2**

（1中国药科大学药物科学研究院新药筛选中心，南京 210009；2广东药科大学新药研发中心，广州 510006）

中药补骨脂是豆科植物补骨脂的干燥成熟果实，具有抗肿瘤（如肝癌、乳腺癌、胃癌等）、治疗骨质疏松和银屑病等多种功效［1］，主要含有香豆素、单萜酚、黄酮、苯并呋喃类等活性成分［2］，补骨脂素（psoralen，PSO）属于其中的呋喃香豆素类化合物［3］。香豆素类化合物进入机体后，分布于心、肝、肺、脾等组织中，然后主要在肝中代谢［4］。

由于环境因素与人们生活方式的改变，肝病的发病率呈现逐年上升趋势，其中化学性肝损伤是常见的病因［5-6］。四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）诱发的急性肝损伤是经典的化学性肝损伤模型，其病理进程与某些人类肝脏疾病类似，故是保肝药物药效评价的常用动物模型［7］。

CYP2E1是细胞色素P450的重要亚型，占肝中总CYP450含量的5%～7%，是肝组织中氯代烃类化合物的主要代谢酶，可以代谢产生有毒或反应性中间体，与多种肝脏疾病的发病机制有关［8］。

目前关于补骨脂素治疗肝脏疾病的报道主要集中在改善肝细胞脂肪变性、抗肝癌以及抗肝纤维化作用方面［9-12］，而对于急性肝损伤药效作用的研究很少。本研究旨在探究补骨脂素对于CCl4致急性肝损伤的改善作用以及可能机制，以期为补骨脂素及补骨脂药材的临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 药品与试剂

补骨脂素（批号JZ18071201，纯度大于98%，南京景竹生物科技有限公司）；烯丙基化硫（diallyl sulfide，DAS，美国Sigma公司）；CCl4（AR级，上海凌峰化学试剂有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；总RNA提取试剂，HiScript®Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）逆转录试剂盒，AceQ®qPCR SYBR®Green Master Mix DNA扩增试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）；GAPDH抗体（美国Proteintech公司）；CYP2E1抗体（英国Abcam公司）。ALT、AST血生化试剂盒（南京威特曼生物科技有限公司）。所用引物由上海英潍捷基公司合成。

1.2 仪 器

BT25S分析天平（德国Sartorius公司）；Legend Micro 21R低温离心机，Varioskan Lux多功能微孔板读数仪，Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪，Applied Biosystems StepOneTM实时荧光定量PCR仪（美国Thermo公司）；TL系列中高通量组织细胞研磨破碎仪（北京鼎昊源科技有限公司）；D1100-230V恒温金属浴（美国Labnet公司）；Power-Pac™HC电泳仪电源，Gel Doc XR+凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；BX53生物显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 动 物

SPF级雌性C57BL/6J小鼠，6～8周龄，体重18~22 g，购自上海灵畅生物技术有限公司，生产许可证号SCXK（沪）2018-0003。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方法

2.1 造模及给药方法

48只雌性C57BL/6J小鼠分为6组，每组8只，分别为溶剂对照组（Control）、模型组（Model）、阳性药组（DAS）、补骨脂素低、中、高剂量组（PSO-L、PSO-M、PSO-H）。补骨脂素给药组每天灌胃给予PSO 25、50、100 mg/kg（0.5% CMC-Na配制的混悬液），阳性药组每天灌胃给予DAS 200 mg/kg，溶剂对照组和模型组灌胃给予相应体积的0.5%CMCNa，连续4 d。模型组、给药组和阳性药组在第4天给药后1 h，单次腹腔注射给予CCl4100µL/kg（橄榄油配制，体积分数为2%），溶剂对照组则腹腔注射给予同样体积的橄榄油。第5天给药结束后2 h眼球采血，颈椎脱臼处死小鼠，分离肝脏。

另取12只C57BL/6J小鼠，6只为对照组，连续灌胃0.5%CMC-Na 5 d，6只为单给补骨脂素组，即单独灌胃PSO 100 mg/kg 5 d，检测对CYP2E1蛋白表达量的影响。

2.2 肝脏指数

小鼠肝脏用生理盐水漂洗干净，滤纸吸干称重，计算肝脏指数，即肝脏占体重的质量分数。

2.3 血清生化指标检测

将小鼠血样3 500 r/min离心10 min，移液器吸取上层血清至1.5 mL EP管中，按血生化试剂盒说明测定血清ALT、AST水平。

2.4 肝脏病理学检测

取肝脏左侧大叶中间部分，在10%中性甲醛中固定48 h，然后进行石蜡包埋、切片、脱蜡、苏木精-伊红（HE）染色，最后在BX53显微镜下观察肝组织病理学形态变化。

2.5 Western blot检测相关蛋白表达

称取肝组织50 mg，加入RIPA裂解液提取肝总蛋白，使用BCA法定蛋白，金属浴煮蛋白，-20℃保存变性蛋白。取等体积蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，在冰上恒流模式下进行转膜，5% BSA封闭2 h，4℃孵育一抗过夜。第2天用TBST洗膜，孵育二抗1 h，再洗膜，采用化学发光法曝光。使用Image J进行蛋白条带的灰度分析。

2.6 RT-PCR检测相关基因表达

称取肝组织30 mg，加Trizol裂解液1 mL提取总RNA。使用超微量核酸蛋白测定仪检测RNA浓度，在逆转录仪上将RNA逆转录成cDNA。运用实时荧光定量PCR法测定cDNA样品中的TNF-α、IL-6和CYP2E1的基因水平。选用GAPDH作为内参基因，引物序列如表1所示。

Table 1 Primer sequences for Real-time quantitative PCR assay

2.7 免疫组织化学染色

将肝组织的石蜡切片进行脱蜡，抗原修复，封闭，4℃一抗孵育过夜，PBS漂洗，室温孵育二抗，再PBS漂洗，DAB显色，苏木精染色，BX53显微镜下观察CYP2E1蛋白表达量变化及肝细胞定位情况。

2.8 统计分析

使用GraphPad Prism 6.01软件进行数据统计处理，实验结果以±s,表示。组间数据统计分析采用One-Way ANOVA检验，P<0.05为差异有统计学意义。免疫组化图使用Image J扫描阳性区域比率进行统计分析。

3 结果

3.1 补骨脂素对CCl4致急性肝损伤模型中小鼠体重及肝脏指数的影响

体重结果如图1所示，各组小鼠在第4天腹腔注射CCl4或者橄榄油后，体重均有所下降，而各组间体重无明显差异。从肝脏指数结果来看，模型组和阳性药组的肝脏指数有所升高，但没有统计学差异；与模型组相比，补骨脂素给药组的肝脏指数则均有明显上升，并呈一定的剂量相关性。

Figure 1 Effect of psoralen(PSO)on the body weight(A)and liver index(B)in CCl4-induced acute liver injury mouse model taking diallyl sulfide(DAS)as positive control(±s,,n=8)

3.2 补骨脂素对CCl4致急性肝损伤模型中小鼠血清生化水平的影响

如图2血清生化结果显示，与溶剂对照组相比，模型组ALT和AST水平显著升高，补骨脂素给药后，呈剂量相关性的降低ALT和AST水平，补骨脂素的中、高剂量组几乎可以使ALT、AST恢复到溶剂对照组水平。

3.3 肝组织病理学检测

肝HE染色结果如图3所示，溶剂对照组小鼠肝细胞结构完整，肝索排列整齐，而模型组可见大量炎性细胞浸润和肝细胞坏死，补骨脂素给药后，低剂量组的肝细胞仍可见部分病变区域，而中、高剂量组改善明显，几乎无肝细胞坏死和炎性细胞浸润，但是补骨脂素给药组均会出现不同程度的肝细胞增大现象，呈现空泡样改变。

3.4 Western blot和RT-PCR测定补骨脂素对CYP2E1蛋白和基因水平的影响

如图4-A所示，与溶剂对照组相比，模型组的CYP2E1表达下调，与模型组相比，补骨脂素给药组的CYP2E1表达均低于模型组，但是随着剂量升高，呈现上调趋势，阳性药组的CYP2E1蛋白表达则无明显变化。

如图4-B所示，与溶剂对照组相比，正常小鼠单给补骨脂素100 mg/kg可以明显下调CYP2E1的蛋白水平。

如图4-C所示，CYP2E1的PCR结果与Western blot结果基本一致，模型组CYP2E1明显下调，补骨脂素给药后有所上调。

Figure 2 Effect of psoralen on serum alanine aminotransferase(ALT)(A)and aspartate aminotransferase(AST)(B)levels in CCl4-induced acute liver injury mouse model(±s,,n=8)

Figure 3 Effect of psoralen on liver histopathology of mice in CCl4-induced acute liver injury mouse model(HE staining,×200)

3.5 免疫组化测定补骨脂素对CYP2E1蛋白表达的影响

免疫组化及半定量分析结果（图5）显示，各组CYP2E1蛋白表达趋势与Western blot结果基本一致，模型组CYP2E1有所下调，而补骨脂素中、高剂量给药后可以上调CYP2E1的表达。

3.6 补骨脂素对CCl4致小鼠急性肝损伤模型中炎症因子基因水平的影响

PCR结果如图6所示，与溶剂对照组相比，模型组炎症因子表达明显上调，补骨脂素给药后可以呈剂量相关性的下调炎症因子基因水平。

Figure 4 Effect of psoralen on the protein and gene expression level of CYP2E1(±s,,n=3-8)

Figure 5 Effect of psoralen on expression of CYP2E1 in CCl4-induced acute liver injury mouse model by IHC and semi-quantitative analysis(±s,,n=3)

Figure 6 Effect of psoralen on mRNA levels of TNF-α(A)and IL-6(B)in CCl4-induced acute liver injury mouse model(±s,,n=8)

4 讨论

在CCl4致小鼠急性肝损伤模型中，主要是破坏肝细胞，使细胞膜通透性改变，细胞内的ALT和AST大量进入血液，导致血液中转氨酶水平显著上升［13］。组织病理学变化主要是肝细胞坏死、炎性细胞浸润和肝索结构排列紊乱［14］。病理进程具有时间依赖性，最早的组织损伤出现在6 h后，12 h左右可以观察到明显的组织损伤，24 h达到损伤高峰［15-16］，所以本研究选择CCl4造模24 h后解剖动物。在补骨脂素给药后，25、50、100 mg/kg 3个剂量均能不同程度地降低转氨酶水平，改善小鼠肝细胞坏死和炎性细胞浸润情况，而且中、高剂量组的改善作用明显。以上结果表明补骨脂素对于CCl4致小鼠急性肝损伤具有明显的改善作用。

CCl4致急性肝损伤模型的发病机制主要是CCl4在CYP2E1的代谢下，产生毒性自由基CCl-3和CCl3O-2，破坏细胞膜结构，使膜通透性增大，引起膜脂质过氧化反应，使肝细胞变性、坏死［17-18］。肝脏是补骨脂素给药后分布最多的器官［19］，也是主要的代谢器官［4］，文献报道补骨脂素对小鼠肝CYP2E1活性和蛋白水平可产生抑制作用［20］。基于以上研究结果提示补骨脂素有可能通过影响CYP2E1发挥肝保护作用。

从Western blot和免疫组化结果来看，模型组的CYP2E1蛋白表达下调，在模型早期，在CCl4的刺激下机体会出现自我保护机制［15］，即大量CCl4进入机体经CYP2E1代谢产生毒性自由基，这些毒性自由基会负反馈抑制CYP2E1的表达。补骨脂素给药后，小鼠肝细胞损伤逐渐改善，产生的毒性自由基减少，对CYP2E1的负反馈抑制作用减弱，所以随着补骨脂素剂量增加，CYP2E1的表达有逐渐上升趋势，但是均低于模型组，这可能是因为补骨脂素本身可以抑制CYP2E1的表达，单给补骨脂素的Western blot结果也证明，补骨脂素100 mg/kg明显抑制CYP2E1的蛋白水平。阳性药DAS是CYP2E1的竞争性抑制剂［21-22］，主要影响CYP2E1的酶活性，对CYP2E1蛋白表达量影响较小，所以与溶剂对照组相比，阳性药组的CYP2E1蛋白水平几乎没有变化。上述结果说明，补骨脂素对于CYP2E1蛋白表达量的抑制，可能与其发挥药效作用的机制有关，通过抑制CYP2E1的表达，减少CCl4经CYP2E1代谢产生毒性自由基，从而拮抗肝损伤。

综上所述，补骨脂素对于CCl4致小鼠急性肝损伤具有改善作用，其可能作用机制之一是抑制CYP2E1的蛋白表达，从而减轻CCl4诱发的急性肝损伤。