抗早颗粒质量标准的建立

钱芳，陈煜

(江苏省中医院 药学部，江苏 南京 210029)

性早熟是一种生长发育异常疾病，主要表现为第二性征提前出现，青春期提前开始，可造成患儿矮身材、性格压抑等[1]。抗早颗粒为临床经验方，由黄柏、知母、枳壳、夏枯草、陈皮等十味中药组成，具有滋阴降火、疏肝理气化痰之功效，用于儿童性早熟的治疗。黄柏、知母共为君药，同用滋阴降火。采用薄层色谱法(TLC)对知母、枳壳、夏枯草进行定性鉴别，使用高效液相色谱法(HPLC)测定黄柏中主要有效成分盐酸小檗碱[2-3]的含量，旨在完善和提高抗早颗粒质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1100 液相色谱仪：美国Agilent公司；Millipore-Q纯水机：美国Millipore公司； 1/10万电子分析天平：BP-211D型，德国Sartorius公司。

1.2 试药

盐酸小檗碱对照品：批号110713-201212，含量86.7%。知母、枳壳、夏枯草对照药材：批号分别为121070-201105、120981-201605、120993-201105，均购于中国食品药品检定研究院。抗早颗粒：批号202004001、202004002、202004003，院内制剂。乙腈：批号1758107446，德国Merck公司。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 知母

供试品溶液：取样品(批号202004001、202004002、202004003)10 g，用40 ml水溶解，正丁醇提取(30 ml×2次)，正丁醇液蒸干后加乙醇40 ml、盐酸4 ml，回流1 h。再加水20 ml，石油醚(60～90 ℃)提取(40 ml×2次)，石油醚液蒸干，加乙酸乙酯1 ml溶解。同法制得知母阴性溶液。

对照药材溶液：另取知母对照药材1 g，加稀乙醇20 ml、盐酸2 ml，回流1 h，滤过，滤液蒸干，加乙酸乙酯1 ml溶解。

展开条件：硅胶G板；点样量5 μl；展开剂为甲苯-丙酮(体积比9∶1)；显色剂为5%香草醛硫酸溶液；105 ℃加热。

结果显示供试品有鉴别点，阴性无干扰，见图1A。

2.1.2 枳壳

供试品溶液：取样品(批号202004001、202004002、202004003)10 g，用40 ml水溶解，乙酸乙酯提取(40 ml×2次)，提取液蒸干，加甲醇1 ml溶解。同法制得枳壳阴性溶液。

对照药材溶液：另取枳壳对照药材0.5 g，加甲醇10 ml，超声30 min，滤过，滤液蒸干，加甲醇2 ml溶解。

展开条件：硅胶G板；点样量5 μl；展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲醇(体积比5∶10∶2)；显色剂为10%硫酸乙醇液；105 ℃加热，365 nm下检视。

结果显示,供试品有鉴别点,阴性无干扰,见图1B。

2.1.3 夏枯草

供试品溶液：取样品(批号202004001、202004002、202004003)10 g，用40 ml水溶解，乙酸乙酯提取(40 ml×2次)，提取液蒸干，加甲醇1 ml溶解。同法制得夏枯草阴性溶液。

对照药材溶液：另取夏枯草对照药材1 g，加水50 ml，煎煮1 h，滤过，滤液同法制备。

展开条件：硅胶G板；点样量5 μl；展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比8∶4∶1.2)；显色剂为5%三氯化铁乙醇液；105 ℃加热。

结果显示供试品有鉴别点，阴性无干扰，见图1C。

2.2 盐酸小檗碱的含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(体积比45∶55)，每100 ml加十二烷基磺酸钠0.1 g。检测波长265 nm，流速1.0 ml·min-1，柱温30 ℃，进样量10 μl。

2.2.2 溶液制备

2.2.2.1 对照品溶液 精密称取盐酸小檗碱对照品，加流动相溶解制成353.74 μg·ml-1的贮备液。取贮备液1 ml，加流动相定容至25 ml(14.15 μg·ml-1)。

2.2.2.2 供试品溶液 取样品(批号202004001)0.5 g，加流动相，超声(功率250 W、频率40 kHz)20 min，加流动相定容至25 ml，摇匀，取续滤液。同法制备黄柏阴性溶液。

2.2.3 专属性试验

分别取“2.2.2”项下3种溶液各10 μl，进样，测定。结果见图2。

2.2.4 线性关系分析

取对照品贮备液(353.74 μg·ml-1)，用流动相稀释至88.435、44.218、22.109、11.054、5.527、2.764 μg·ml-1，进样，测定。以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，得回归方程Y=47.241X+ 3.234 3，r=1.000 0(n=6)。盐酸小檗碱在2.764～88.435 μg·ml-1范围内，线性关系良好。

2.2.5 精密度试验

取对照品溶液(14.15 μg·ml-1)10 μl，按“2.2.1”色谱条件，测定峰面积，RSD=0.67%(n=6)。表明仪器有良好的精密度。

A. 知母；B. 枳壳；C. 夏枯草。1.对照药材；2、3、4. 供试品(批号202004001、202004002、202004003)；5. 阴性

2.2.6 重复性试验

取样品(批号202004001)0.5 g，共6份，按“2.2.2.2”方法制备供试液，测定。盐酸小檗碱平均含量为0.691 mg·g-1，RSD=1.18%(n=6)。表明方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验

取同一供试液(批号202004001)，放置0、2、4、6、8、12 h，按“2.2.1”色谱条件测定，峰面积RSD=0.67%(n=6)。表明供试液12 h内稳定。

2.2.8 加样回收试验

取样品(批号202004001，含量0.696 mg·g-1)0.25 g，共9份，加入盐酸小檗碱对照品，按“2.2.2.2”方法制备供试液，测定。结果见表1。

2.2.9 样品含量测定

取样品(批号202004001、202004002、202004003)，按“2.2.2.2”方法制备供试液，按“2.2.1”色谱条件测定。盐酸小檗碱含量分别为0.696、0.698、0.684 mg·g-1。

3 讨 论

3.1 TLC条件选择

3.1.1 知母的TLC鉴别

知母含有知母皂苷BⅡ、菝葜皂苷元、芒果苷等[4-5]。参考药典[6]以乙醇-水(体积比1∶1)为展开剂以及文献[7]以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(体积比5∶3∶1∶1)为展开剂，鉴别知母中的芒果苷，未见鉴别点；以正丁醇-冰醋酸-水(体积比4∶1∶5)[6]为展开剂，鉴别知母皂苷BⅡ，也未见鉴别点；而参考文献[8]方法提取样品，以甲苯-丙酮(体积比9∶1)为展开剂，鉴别菝葜皂苷元，斑点清晰，专属性强。

3.1.2 枳壳的TLC鉴别

枳壳和陈皮中均含有橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷[9-11]。以乙酸乙酯-甲醇-水(体积比10∶2∶3)上层溶液[12]、二氯甲烷-甲醇-水(体积比13∶6∶2)下层溶液[13]、三氯甲烷-丙酮-甲醇(体积比5∶1∶1)[14]为展开剂，鉴别点阴性有干扰；而以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(体积比5∶10∶2)[15]为展开剂，鉴别点清晰，阴性无干扰。

3.1.3 夏枯草的TLC鉴别

夏枯草中主要含有酚酸类、萜类[16-18]。参考药典以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲酸(体积比15∶3∶3.5∶0.5)[19]，参考文献以乙酸乙酯-甲酸-水(体积比8∶1∶1)[20]、三氯甲烷-甲醇-冰醋酸-水(体积比7∶2∶0.5∶0.3)[21]为展开剂，未见鉴别点；而以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比8∶4∶1.2)[22]为展开剂，鉴别点清晰，专属性强。

3.2 流动相的选择

曾以乙腈-水、乙腈-磷酸水为流动相，结果盐酸小檗碱色谱峰出现拖尾，而用本研究流动相时，出峰时间适中，峰形较好，分离度>1.5。

3.3 提取方法和提取条件的选择

分别用超声(功率250 W、频率40 kHz)和回流30 min的方法提取样品，结果盐酸小檗碱含量无明显差异。因用超声方法提取样品较为简单快捷，故选择此法。

用流动相、不同浓度甲醇和乙醇超声(功率250 W、频率40 kHz)30 min提取样品，结果流动相最佳。

样品加流动相，分别超声(功率250 W、频率40 kHz)20、30、40 min，结果盐酸小檗碱含量无明显差异，故选择超声时间为20 min。

3.4 色谱柱考察

试验中使用Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hedera C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，不同色谱柱含量无明显差异，且有较好的分离度。

3.5 结论

建立的质量标准操作简便、快速，结果准确，可用于抗早颗粒的质量控制。