一株放射型根瘤菌发酵产物分析

刘咏梅，沈 路，孔 琪

（泰州职业技术学院，江苏 泰州 225300）

多糖是由糖苷键连接的，由多个单糖组成，结构多变，类型多样，是生命体保持活力健康的重要原因。因此，多糖与核酸、蛋白质和脂质一起被誉为“生命的基础”[1]。有些多糖是动植物体的重要组分，具有储藏能量的作用。一方面，虽然来源种类多样，但提取、纯化成本高，且原材料受季节因素限制；另一方面，微生物的发酵时间较短，季节的变化不会影响其生产发酵，所得产物提取简便。

微生物多糖是经微生物发酵生成的胞内、胞外多糖或从微生物细胞中提取的多糖的总称，由微生物分泌至胞外并形成黏液或荚膜的多糖被称为微生物胞外多糖（Extracellular Polysaccharide，EPS）。许多微生物产可溶性或不溶性胞外多糖[2-3]。微生物多糖具有独特的属性，这些属性在植物多糖中是不存在的[4]。微生物多糖凭借其物理特征和流变特性，有增稠、乳化等作用，在许多领域得到应用[5]。因此，EPS得到了广泛关注。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌株

放射型根瘤菌（Rhizobium radiobacter）（CFCC2272，中国林业微生物保藏管理中心）。

1.1.2 主要试剂

葡萄糖、蔗糖、酵母膏、琼脂、蛋白胨、碳酸钙、牛肉浸膏、苯酚红等（国药集团化学试剂有限公司）。

1.1.3 仪器与设备

电子天平，生化培养箱，全温摇瓶柜，超净工作台，分析天平，手提式压力蒸汽灭菌器，台式高速离心机。

1.1.4 培养基

种子培养基：蔗糖10.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 1.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 L。

发酵培养基：蔗糖20.0 g，酵母粉1.0 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，蒸馏水1 L。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法

在斜面培养基上接根瘤菌，在30 ℃下培养24 h后备用。

于斜面培养基取1环菌，接入种子培养基，在28 ℃、 180 r/min条件下摇瓶培养1 d后备用。

1.2.2 多糖提取

取20 mL发酵液，以8 000 r/min离心10 min，取上清液，加入3倍体积95%乙醇沉淀，获得多糖粗产物。

1.2.3 产物纯化

采用Sevage法除蛋白（两次），95%乙醇沉淀，收集产物，在200～400 nm波长范围内扫描，样品中的蛋白去除后冷冻干燥。

2 实验结果

2.1 菌体形态特征

图1、图2分别为根瘤菌CFCC2272在发酵培养基中培养2 d后的形态及电子显微镜下的形态。由图1可见，在发酵培养基平板上，菌落表面形成一层厚厚的多糖产物；图2显示，该菌大小为（0.8～1.2）×（1.5～2.5） μm，且细胞外部有多糖分泌。

图1 根瘤菌CFCC2272菌落特征

图2 根瘤菌CFCC2272电子显微镜照片

2.2 胞外多糖红外光谱

红外光谱已经成为化合物鉴定的方法之一。对于混合物而言，峰形代表混合物的变化，会引起分子振动和转动的变化，也可能导致红外光谱整体谱图的变化[6]。

利用菌株发酵培养90 h后，离心收集上清液，采用Sevage法提纯并冷冻干燥获得产品。取多糖样品与KBr混合，研磨制片。图3为根瘤菌CFCC2272胞外多糖红外光谱图。由图3可知，在3 500～3 000 cm-1范围内有一特征吸收峰，最大吸收峰在3 143 cm-1附近，此处为O—H键伸缩振动吸收峰，说明产物中有大量O—H基团存在。在1 684 cm-1附近有酰胺特征吸收峰，为酰胺结构中C=O双键伸缩振动吸收峰。1 400 cm-1附近的吸收峰可能为仲酰胺基团中的C—N键伸缩振动引起[7]。从红外光谱图可以看出，与放射型根瘤菌吸收峰特征相契合。

图3 根瘤菌CFCC2272胞外多糖红外光谱