固载离子液体修饰Fe3O4纳米酶用于 H2O2和葡萄糖的检测

杨培昕，喻昌木，杨 敏,，张 荣，汤陆扬，付阳洋，彭黔荣,3,

（1.贵州大学药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学化学与化工学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州中烟工业有限责任公司技术中心，贵州 贵阳 550009）

近年来，人工模拟纳米酶由于具有与天然辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）类似的过氧化物酶活性而被人们广泛关注，与天然酶相比，人工模拟纳米酶具有高催化活性、稳定性好、成本低的优势[1-2]。 2007年，研究人员首次报道了Fe3O4磁性纳米颗粒具有与天然过氧化物酶类似的过氧化物酶活性[3]。但是Fe3O4磁性纳米颗粒容易聚集和氧化，改善Fe3O4纳米酶一直是研究的热点。有研究人员通过在Fe3O4表面官能化具有过氧化物酶活性的金磁微粒（Fe3O4@Au），从而提高复合纳米颗粒的过氧化物酶样活性[4]。HRP在含有水（体积分数4.53%）的一种亲水性离子液体（ionic liquid，IL） （[bmim][BF4]）中可增加其活性和稳定性[5]。Walsh等[6]发现，在IL中可发生许多氧化还原反应，使其修饰的材料具有成为高性能催化剂的潜质。据了解，IL是一种由离子组成且常温下呈液态的离子化合物。与传统有机溶剂相比，IL具有热稳定性、可重复性、低毒性以及对金属催化剂、有机物、无机物和气体物质的溶解性等性能[7-9]。 在生物催化过程中，IL可提供不同的溶剂环境，使生物酶的活性增大；在反应过程中，IL和酶均可循环利用，提高酶的催化效率；并且其与部分有机溶剂互不相溶，可使酶催化产物易于分离[10-12]。在此构建IL修饰的Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒，在SiO2包覆的Fe3O4纳米粒子表面接枝IL涂层，获得SiO2固载IL修饰的磁性纳米粒子Fe3O4@SiO2@IL，用于葡萄糖和H2O2的检测。

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）在有氧条件下能专一性地催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和H2O2[13]。检测H2O2和葡萄糖的方法较多，比色传感器具有操作简单、快速、方便等特点，广泛应用于生物分析、环境检测、食品检测和医疗诊断等领域[14]。将Fe3O4@SiO2@IL与GOD耦合，Fe3O4@SiO2@IL催化反应产物H2O2与过氧化物酶底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）形成蓝色产物。基于此原理，构建一种具有理想选择性和较高灵敏度的简便方法，以期为人工模拟纳米酶在食品检测中的应用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛奶 市购；GOD（98%） 北京百灵威科技有限公司；乙酸钠、三水合物（分子C2H9NaO5）（优级纯，99.5%） 苏州市麦克林医疗器械制品有限公司；3-氯丙基三乙氧基硅烷（98%） 国药集团化学试剂有限公司；N-甲基咪唑（98%） 常州市中凯化工有限公司；正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS，分析纯） 成都科龙化工试剂厂；TMB（98%）、FeCl3•6H2O、氯化铁（II）（FeCl2•4H2O）、30% H2O2等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-9000紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；Nicolet iS50原位漫反射傅里叶变换红外光谱仪 美国赛默飞世尔科技有限公司；S-3400N扫描电子显微镜 日本Hitachi公司；JEM-2100透射电子显微镜 日本电子公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4磁性纳米颗粒的制备

Fe3O4磁性纳米颗粒通过共沉淀法[15]制备。将FeCl3•6H2O（0.02 mol）和FeCl2•4H2O（0.01 mol）溶解在90 mL蒸馏水中，并将所得溶液在氮气下100 ℃回流3 h。然后，将质量分数25%氨水溶液10 mL逐滴加入上述混合物中，并混合搅拌2 h。反应完成后，将混合物冷却至室温，通过使用外部磁体简单收集所得磁性纳米颗粒，然后用蒸馏水彻底洗涤，烘干备用。

1.3.2 Fe3O4@SiO2磁性微球的制备

通过溶胶-凝胶法[16]，制备SiO2壳层。取上述合成的Fe3O4颗粒0.5 g，并均匀分散在乙醇（40 mL）、去离子水（10 mL）和1.5 mL浓氨水溶液（28%）的混合溶液中，并超声处理1 h。在30 ℃条件下预搅拌15 min后滴加TEOS（0.4 mL），继续搅拌6 h。收集所得微球，用乙醇和去离子水洗涤，45 ℃真空干燥12 h，得SiO2涂覆的磁性Fe3O4纳米颗粒（Fe3O4@SiO2）。

1.3.3 Fe3O4@SiO2@IL磁性纳米粒的制备

参考文献[17]并进行改进，制备IL涂层。取3-氯丙基三乙氧基硅烷（2.408 g，10 mmol）和Fe3O4@SiO2（3 g）加入到80 mL无水甲苯中，在氮气下回流12 h。冷却至室温，过滤，并用无水甲苯和无水乙醚洗涤2 次，除去未反应的反应物。然后80 ℃真空干燥6 h得到中间体Fe3O4@SiO2@(CH2)3Cl。将N-甲基咪唑（10 mmol）和Fe3O4@SiO2@(CH2)3Cl（1 g）加入到50 mL无水甲苯溶液中，并将混合物回流12 h。过滤生成的产物，并用无水乙醚洗涤以除去过量的IL，干燥，所得固体即Fe3O4@SiO2@IL。

1.3.4 材料的表征

将微量固体磁性材料溶于适量的蒸馏水，超声振荡使其均匀分散。利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察材料形貌。将合成的干燥纳米粒子粉末与KBr混合，充分研磨后压片，利用原位漫反射傅里叶变换红外光谱仪分析材料结构。

1.3.5 Fe3O4@SiO2@IL过氧化物酶活性分析及条件优化

通过测定H2O2存在下过氧化物酶底物TMB的催化氧化能力，可以估算Fe3O4@SiO2@IL纳米材料的过氧化物酶活性。实验如下：将Fe3O4@SiO2@IL（300 μL，0.4 mg/mL）、H2O2（300 μL，80 mmol/L）和NaAc缓冲溶液（300 μL，50 mmol/L，pH 3）以及TMB（300 μL，8 mmol/L）混合均匀后在40 ℃下孵育20 min。然后记录在波长652 nm处（TMB的特征峰）的紫外-可见吸收。类似地，根据相同步骤研究不同pH值的NaAc缓冲溶液（pH 2～9）、孵育温度（20～80 ℃）、孵育时间（0～20 min）和催化剂质量浓度为0～0.5 mg/mL范围内Fe3O4@SiO2@IL过氧化物酶活性的变化。

1.3.6 动力学分析

首先，保持TMB浓度恒定并改变H2O2浓度（0.1～1.0 mmol/L），加入乙酸钠缓冲液（300 μL，50 mmol/L，pH 3）和Fe3O4@SiO2@IL（300 μL， 0.4 mg/mL）制成不同浓度的混合溶液，并在50 ℃下孵育20 min后，通过紫外-可见光分光光度计在波长652 nm处测定混合物的吸光度。类似地，通过在相同条件下保持H2O2浓度恒定并改变TMB浓度（0.1～1.0 mmol/L），研究以H2O2为底物的动力学分析。

通过从Michaelis-Menten方程导出的Lineweaver-Burk图以计算酶动力学参数：1/V=Km/Vmax（1/[S]+1/Km）；其中，V为反应的初始速率/（mol/（L·s））；Vmax为最大反应速率/（mol/（L·s））；[S]为底物的浓度/（mol/L）；Km可近似代表酶对底物的亲和，Km值一般在10－6～ 10－2mol/L范围内。

在此，根据Lambert-Beer定律（A=k×b×c）对Ox-TMB浓度进行定量。其中，A为吸光度；b为溶液厚度/cm；c为Ox-TMB的浓度/（mol/L）；k为摩尔吸光系数，通常为39 000/（L/（mol•cm））[18-20]。

1.3.7 H2O2和葡萄糖的检测

1.3.7.1 H2O2的检测

将TMB（300 μL，8.0 mmol/L）、Fe3O4@SiO2@IL 储备溶液（300 μL，0.4 mg/mL）和不同浓度的H2O2溶液（0.001～1 mmol/L）加入到2 mL乙酸盐缓冲液（pH 3.0，50 mmol/L）中，然后将混合溶液在40 ℃温育20 min后通过紫外分光光度计测量在波长652 nm处吸光度的变化。

1.3.7.2 葡萄糖的检测

将GOD（0.2 mL，1.0 mg/mL）、1.0 mL不同浓度的葡萄糖（0.02～0.2 mmol/L）加入到1 mL磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中混合，并在37 ℃温育30 min；之后，将Fe3O4@SiO2@IL（300 μL，0.4 mg/mL）、TMB（300 μL，8 mmol/L）和乙酸盐缓冲液（2 mL，50 mmol/L，pH 3）添加至上述葡萄糖反应溶液中，并在40 ℃下温育20 min。最后在紫外分光光度计下测量其在波长652 nm处的吸光度变化。为了测试葡萄糖检测的选择性，选择蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖进行对照实验，对照样品的浓度高于葡萄糖的浓度（约5 倍）。

1.3.7.3 实际样品的检测

建立的检测方法用于牛奶中H2O2的检测。样品的预处理：首先向25 mL牛奶样品中添加1%（体积分数）三氯乙酸25 mL，并超声处理20 min去除牛奶样品中的蛋白质；然后以12 000 r/min离心10 min，将上清液通过0.22 μm膜过滤，除去脂质；通过向该上清液中添加不同浓度的H2O2储备溶液，制备不同浓度的H2O2牛奶样品。取不同浓度的牛奶样品100 μL分别加入300 μL Fe3O4@SiO2@IL悬浮液（0.4 mg/mL）和300 μL TMB （8.0 mmol/L），加入到2 mL乙酸盐缓冲液（pH 3.0，50 mmol/L）中，然后在40 ℃温育20 min。根据上述1.3.7.1节方法测量吸光度的变化，重复3 次，考察检测体系的加标回收率。

2 结果与分析

2.1 材料的表征

采用共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒，然后以TEOS为硅源制备SiO2壳层，目的是提高纳米材料的分散性，并且保护磁铁矿芯在使用过程中不被腐蚀和氧化[16]。 加入3-氯丙基三乙氧基硅烷，经回流改性与硅胶层形成Si—O—Si键，从而表面接枝带上氯丙基，获得中间体Fe3O4@SiO2@(CH2)3Cl[21-22]。最后通过N-甲基咪唑与修饰在硅胶壳上的氯丙基反应，形成了带N-甲基咪唑氯鎓的固定化IL。IL由于相同电荷之间的排斥作用，能够有效减少聚集，增强稳定性。如图1所示，将裸露的Fe3O4磁性纳米颗粒溶于水中，大部分颗粒聚集在底部，分散性差；而IL修饰后的Fe3O4磁性纳米颗粒（Fe3O4@SiO2@IL）在水溶液中呈现出较好的分散性和顺磁性，使其可以很容易地从反应介质中分离出来，增强重复利用性。

图1 Fe3O4@SiO2@IL的合成原理示意图Fig. 1 Schematic diagram for the synthesis principle of Fe3O4@SiO2@IL

如图2、3所示，在Fe3O4的光谱中可以看到O—H在3 100～3 500 cm－1附近的伸缩振动和Fe—O在575 cm－1附近的伸缩振动（a谱）。出现在1 090 cm－1处的宽吸收峰是Si—O—Si拉伸振动的特征峰（b谱），表明形成了SiO2壳层。1 584 cm－1处的峰可归因于双键咪唑环的C＝N 拉伸（c谱），表明IL已成功地修饰在Fe3O4@SiO2上。从图3A可以看出，Fe3O4纳米颗粒呈颗粒状聚集体的簇状结构，经SiO2壳层涂覆后形成较为分散的颗粒状 （图3B）。相较于图3A、B，IL修饰后的纳米材料形貌发生了变化，大多数表现为表面光滑的球状结构（图3C），说明Fe3O4纳米颗粒可能与IL发生了某种特定的相互作用。使用透射电镜进行更详细的观察，如图3D所示，证实本实验制备的Fe3O4@SiO2@IL为均一的球形，且直径约为20 nm。

图2 傅里叶变换红外光谱图Fig. 2 FT-IR spectra of Fe3O4, Fe3O4@SiO2 and Fe3O4@SiO2@IL

图3 Fe3O4（A）、Fe3O4@SiO2（B）和Fe3O4@SiO2@IL（C）的扫描电镜和Fe3O4@SiO2@IL的透射电镜（D）图Fig. 3 SEM images of Fe3O4 (A), Fe3O4@SiO2 (B) and Fe3O4@SiO2@IL (C) and TEM image of Fe3O4@SiO2@IL (D)

2.2 Fe3O4@SiO2@IL类过氧化物酶活性分析

为了研究在H2O2和底物TMB存在下Fe3O4@SiO2@IL的过氧化物酶样活性，比较有无H2O2和TMB时的比色反应。如图4所示，在对照组实验中，缺少H2O2或TMB时，曲线1和曲线2无明显的紫外吸收。而TMB与H2O2存在下，在波长652 nm处出现了一个明显的吸收峰（曲线3）。这是由于Fe3O4@SiO2@IL在H2O2存在下能氧化TMB，使溶液变蓝（如插图所示），并在波长652 nm处产生特定的吸收峰。实验表明，制备的Fe3O4@SiO2@IL具有较好的类过氧化物酶活性。

图4 不同反应体系溶液的紫外-可见光吸收图谱Fig. 4 UV-Vis absorption spectra of different reaction system solutions

另外，类似于天然过氧化物酶HRP，基于纳米材料的过氧化物酶模拟物的酶活性受pH值和温度等条件影响。在缓冲溶液pH 2～9、孵育温度20～80 ℃的范围内研究酸度和温度对体系中显色产物吸光度的影响，结果显示pH 3、孵育温度40 ℃时达到最佳催化活性 （图5A、B）。接着研究Fe3O4@SiO2@IL质量浓度对体系中显色产物吸光度的影响，如图5C所示，在Fe3O4@SiO2@IL质量浓度为0～0.5 mg/mL范围内，显色产物吸光度随Fe3O4@SiO2@IL质量浓度增加而增加，当Fe3O4@SiO2@IL质量浓度达到0.4 mg/mL时，逐渐趋于平衡。同理，如图5D、E所示，在H2O2浓度为10～100 mmol/L和TMB浓度为1～10 mmol/L范围内，浓度增加其催化活性也随之增加，当H2O2浓度达到80 mmol/L或TMB浓度达到8.0 mmol/L时，Fe3O4@SiO2@IL催化活性趋于平衡，并且选择最佳孵育时间为20 min（图5F）。根据优化结果，选择Fe3O4@SiO2@IL 0.4 mg/mL、H2O280 mmol/L和TMB 8 mmol/L进行后续实验。

图5 pH值（A）、孵育温度（B）、Fe3O4@SiO2@IL质量浓度（C）、H2O2（D）、TMB（E）以及孵育时间（F）对酶活性的影响Fig. 5 Effects of pH (A), temperature (B), concentrations of Fe3O4@SiO2@IL (C), H2O2 (D), TMB (E) and incubation time (F) on peroxidase mimic activity

2.3 Fe3O4@SiO2@IL的稳态动力学分析

通过改变一种底物的浓度，同时保持另一种底物的浓度不变，测定一系列的动力学数据，研究催化机理，获得相应的动力学参数。如图6所示，在合适的TMB和H2O2浓度范围内观察到与酶促反应相似的典型Michaelis-Menten行为。由双倒数Lineweaver-Burk方程可得到最大初速度（Vmax）和Michaelis-Menten常数（Km）等基本参数：1/V=Km/Vmax（1/[s]+1/Km）。通过计算15 min内波长652 nm处吸光度变化斜率，得到表观反应速率，如表1所示。Km值通常被认为是酶与特定底物亲和力的指标。Km值越小，说明酶与底物的亲和力越强，所研究催化剂的效率越高。由表1可以看出，以TMB（0.107 mmol/L）和H2O2（0.245 mmol/L）为底物的Fe3O4@SiO2@IL的Km值远低于HRP（0.434 mmol/L和3.700 mmol/L），说明Fe3O4@SiO2@IL对TMB和H2O2的亲和力远高于HRP。另一方面，在不同固定TMB浓度下，TMB对H2O2的氧化反应双倒数曲线呈一组线性平行线（图6C、D），这是典型的乒乓机制[23-24]。与其他具有过氧化物酶活性的纳米材料相比，Fe3O4@SiO2@IL的Km值均具有较大优势，这进一步证实了IL修饰的Fe3O4纳米颗粒与比色底物TMB和H2O2具有较好的亲和性。

图6 Fe3O4@SiO2@IL的稳态动力学图Fig. 6 Steady-state kinetics of Fe3O4@SiO2@IL

表1 Fe3O4@SiO2@IL纳米材料与其他纳米酶和HRP的Km和 Vmax参数的比较Table 1 Km and Vmax values of Fe3O4@SiO2@IL nanomaterials, other nanozymes and HRP

2.4 H2O2和葡萄糖的检测

体系中Fe3O4@SiO2@IL表现出过氧化物酶活性，能够有效催化H2O2氧化TMB发生显色反应。TMB的显色程度与H2O2浓度呈正比。因此，考察紫外吸收光谱652 nm（TMB的特征峰）处的吸光度可有效检测H2O2。基于此，通过结合GOD与葡萄糖反应生成H2O2的原理，可间接检测葡萄糖。原理如图7所示，GOD在有氧条件下作用于葡萄糖生成葡萄糖醛酸，同时产生H2O2。Fe3O4@SiO2@IL与产物H2O2反应生成H2O和O2，然后与第2底物TMB反应生成蓝色产物TMBox[23]。

图7 葡萄糖比色测定原理图Fig. 7 Schematic diagram for the colorimetric determination of glucose

由图8A可知，体系在波长652 nm处（TMB的特征峰）的吸光度随H2O2浓度的增加而增大，然后趋于平衡。同源线性校准曲线（图8B）表现出在最佳条件下，吸光度与H2O2浓度在4～100 μmol/L范围内呈线性关系，其线性方程为y=0.049 57+0.938 17x，相关系数为 0.996 49。检出限（limit of detection，LOD）为 0.698 μmol/L。其中LOD的精确度（相对标准偏差（relative standard deviation，RSD））为0.304%（n=5）。与其他过氧化物酶模拟物相比（表2），Fe3O4@SiO2@IL具有更宽的线性检测范围和更低的LOD。

图8 H2O2浓度与吸光度的剂量-响应曲线（A）及同源性 校准曲线（B）Fig. 8 Plot of H2O2 concentration versus absorbance (A) and calibration curve (B)

表2 检测H2O2材料的性能比较Table 2 Performance comparison of various materials for detecting H2O2

如图9所示，在0.008～0.2 mmol/L范围内，吸光度与葡萄糖浓度呈良好的线性关系。LOD为2.39 μmol/L，与先前报道的其他过氧化物酶模拟物相比（表3），Fe3O4@SiO2@IL具有较低的葡萄糖LOD。

表3 检测葡萄糖纳米材料的性能比较Table 3 Performance comparison of various nanomaterials for glucose detection

图9 葡萄糖检测的剂量-响应曲线（A）和葡萄糖浓度变化的 紫外吸收光谱图（B）Fig. 9 Plot of glucose concentration versus absorbance (A) and UV-Vis spectra of varying glucose concentrations (B)

2.5 Fe3O4@SiO2@IL的干扰性

为了进一步研究该方法的特异性，选择空白样品、蔗糖、果糖、乳糖和麦芽糖进行对照实验。如图10所示，即使对照样品的浓度是葡萄糖浓度的5 倍，含葡萄糖样品的吸光度也远高于对照样品。此外，蔗糖、果糖、乳糖和麦芽糖样品中，肉眼可观察到葡萄糖样品的蓝色变化（插图）。结果表明，该比色法反应体系对葡萄糖具有较高的选择性。

图10 葡萄糖的选择性检测（n=3）Fig. 10 Selectivity for glucose detection (n= 3)

2.6 Fe3O4@SiO2@IL的稳定性

连续7 d测量Fe3O4@SiO2@IL纳米材料吸光度的变化，评估其长期贮存稳定性。如图11所示，Fe3O4@SiO2@IL在一周内具有较好稳定性，表明Fe3O4@SiO2@IL具有良好的长期贮存稳定性。

图11 Fe3O4@SiO2@IL的稳定性（n=3）Fig. 11 Stability of Fe3O4@SiO2@IL (n = 3)

2.7 实际样品的检测

H2O2通常被用作生乳中的保鲜剂，但是，过量添加H2O2不仅会降低牛奶的营养价值，还会导致胃肠道疾病，因此，检测牛奶中H2O2的含量具有重要意义。基于Fe3O4@SiO2@IL的过氧化物酶样活性比色传感器检测牛奶中的H2O2，结果如表4所示，测定牛奶样品中H2O2的回收率为94.0%～107.8%，RSD为2.24%～3.12%。表明Fe3O4@SiO2@IL纳米材料可以有效用于牛奶中H2O2的测定，并且具有较高的准确度和精密度，在实际样品分析中具有潜在的应用价值。

表4 牛奶样品中H2O2的测定Table 4 Recoveries of H2O2 in spiked milk samples

3 结 论

采用共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒并添加SiO2壳层，然后将3-氯丙基三乙氧基硅烷接枝在Fe3O4@SiO2纳米颗粒上并与N-甲基咪唑进一步反应，合成具有IL涂层的Fe3O4磁性纳米颗粒。研究证明，Fe3O4@SiO2@IL有效改善了Fe3O4磁性纳米颗粒的聚集。在优化条件下，Fe3O4@SiO2@IL表现出较好的过氧化物酶样活性和对底物TMB和H2O2的亲和性，在H2O2存在下可催化过氧化物酶底物TMB氧化产生蓝色反应。基于Fe3O4@SiO2@IL 的过氧化物酶性质，开发一个简单而灵敏的葡萄糖和H2O2检测平台，用于牛奶中H2O2的检测，加标回收率为94.0%～107.8%。Fe3O4@SiO2@IL具有构建低成本和简单生物传感器的巨大潜力，并为人工模拟酶应用于食品检测提供了参考。