LLE-GC-MS-SIM检测白酒中9 种微量功能成分

史改玲，郭 莹，李景辉，王国明，尹翠娟，李秋志，张翠英,

（1.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2.承德避暑山庄企业集团股份有限公司，河北 承德 067500）

中国传统白酒以高粱、玉米、红薯等高淀粉谷物为原料，酒曲作为糖化发酵剂，采用多菌种固态、半固态或液态发酵方式，结合蒸馏、勾调技术及后续贮存体系，给白酒带来丰富的微量成分，这些成分或构成白酒骨架香气、或赋予白酒独特风格和口感、有的赋予白酒多种功效作用[1-2]。白酒中的萜烯类化合物具有重要生理功能或生物活性，如柠檬烯在酒体中能抑制蛋白质的异戊二烯化，具有一定抗癌作用[3]；对伞花烃是右旋柠檬烯转变来的芳香烃化合物，有缓解骨骼疼痛、促进血液循环等功效[4-5]。Bourgou[6]、Wang Chungyi[7]、张倩[8]等国内外学者通过体外实验证明了萜烯类化合物的抗氧化活性；Schepetkin等[9]研究表明一定浓度的萜烯类化合物还具有调节人体嗜中性粒细胞反应的功效。酚类化合物不仅是白酒中重要的风味物质，更是一类具有生理活性的功能成分，4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚不仅是良好的抗氧化成分，还可以预防疾病、延缓衰老、增强机体免疫力、降低血糖活性[10-12]；麝香草酚具有抗菌活性、祛痰治咳等作用[13]；异丁香酚具有抗氧化、防腐功效[14]。四甲基吡嗪是白酒中重要的健康功能因子，具有调节心脏收缩、抗氧化、保护大脑、预防脊髓损伤、抗肿瘤、预防糖尿病，修复损伤肝肾等作用[15-17]。亚油酸乙酯等高级脂肪酸酯，以胶体物胶核的形式存在于白酒中，进入人体后分解成高级脂肪酸，降低胆固醇和血脂含量，能有效预防或减轻脉粥样硬化症状[18]。

气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术因其分离效果好、分析速度快、样品用量少和应用范围广等优点被广泛应用于白酒微量成分分析中，更是检测微量功能成分的重要手段之一。刘奕霏等[18]建立了白酒中亚油酸乙酯的GC-MS检测方法，该方法检测高效、准确、灵敏度高，能有效分析白酒中亚油酸乙酯含量。史冬梅等[19]利用GC-MS检测103 种白酒中6 种酚类化合物，结果表明不同香型白酒中酚类化合物含量差异较大，浓香型和芝麻香型白酒中相对含量较高。李安军等[20]采用顶空固相微萃取结合全二维气相色谱-飞行时间质谱联用法检测出白酒中吡嗪类、萜烯类、烯烃、酯类、有机酸等健康成分。

近年来白酒功能成分的研究日益受到各界学者的关注，但是多集中于白酒功能成分的定性分析或者特定某一类功能成分的定量分析，鲜有多种功能成分的综合定量分析。本研究采用液液萃取-气相色谱-质谱-选择离子扫描（liquid-liquid extraction-gas chromatography-mass spectrometry-selective ion monitoring，LLE-GC-MS-SIM）定量检测20 种白酒中D-柠檬烯、对伞花烃、叶绿醇、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、麝香草酚、异丁香酚、四甲基吡嗪及亚油酸乙酯含量，旨在为白酒微量功能活性物质的研究提供一定数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

20 种酒样详细信息见表1，酒样W01～W09来自山庄酒厂，W10～W20为市售酒样。标准品D-柠檬烯、对伞花烃、四甲基吡嗪、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、麝香草酚、异丁香酚、亚油酸乙酯、叶绿醇均购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。

表1 酒样信息Table 1 Information of Baijiu samples tested in this study

1.2 仪器与设备

Trace 1310-ISQ气相色谱-质谱联用仪 美国赛默飞公司；SE812型氮吹仪 北京帅恩科技有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 标准品制备

以正己烷为溶剂配制亚油酸乙酯质量浓度为100.00 mg/L，叶绿醇、麝香草酚、异丁香酚质量浓度为10.00 mg/L，其余5 种物质质量浓度为50.00 mg/L的单标母液，将这9 种单标稀释配制成亚油酸乙酯质量浓度为10 mg/L，叶绿醇、麝香草酚、异丁香酚质量浓度为1.00 mg/L，其余标准品质量浓度为5.00 mg/L的混合标准母液并分别稀释5、25、100、500、1 000 倍作为梯度混合标准溶液备用。

1.3.2 样品前处理

超纯水稀释酒样至乙醇体积分数10%；吸取20 mL稀释酒样于100 mL分液漏斗中，分别用等量正己烷、乙醚、乙醚-戊烷（1∶1，V/V）分3 次萃取后合并有机相，加入无水硫酸钠，－20 ℃条件下静置吸水1 h后过滤得到纯有机相，氮吹浓缩至2 mL，0.22 μm滤膜过滤后进样，每个样品3 次重复。

1.3.3 GC-MS检测分析

色谱条件：Agilent InnonWax型毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.2 μm）；进样口温度250 ℃，载气为He，流速1 mL/min，不分流模式，进样量1 μL；升温程序：50 ℃保持3 min，以4 ℃/min的速率升温至170 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min的速率升温至230 ℃，保持5 min。

质谱条件：电子电离源，电子能量70 eV；离子源温度250 ℃，激活电压1.5 V；溶剂延迟5 min；定性采用全扫描模式，扫描范围30.00～350.00 u。

1.3.4 定量分析

定量采用SIM模式，以待定量物质峰面积（y）为纵坐标，待定量物质质量浓度（x）为横坐标建立标准曲线，线性相关系数进行评估，计算酒样中功能成分的含量。

1.4 数据分析

数据统计分析及表格制作采用软件Microsoft Excel。

2 结果与分析

2.1 SIM参数选择

9 种功能成分标准溶液的色谱图、质谱图如图1、2所示，定量分析采用的SIM参数见表2。

图1 9 种功能成分的总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion current chromatogram of nine functional components

表2 SIM模式参数Table 2 SIM parameters for nine functional components

图2 9 种功能成分标准品质谱图Fig. 2 Mass spectra of nine functional component standards

2.2 线性范围、检出限和定量限

6 个梯度的功能成分混合标准溶液进行GC-MS分析，以质量浓度-峰面积进行线性回归，绘制标准曲线，9 种功能成分在各自的线性范围内R2均大于0.990 0，线性关系良好（表3）。以目标化合物色谱峰信噪比大于3的质量浓度确定为检出限，信噪比大于10的质量浓度确定为定量限，结果见表3。

表3 9 种功能成分的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量限Table 3 Calibration curve equations, linear ranges, correlation coefficients, LODs and LOQs for nine functional components

2.3 回收率和精密度实验结果

制备亚油酸乙酯终质量浓度为100、400、1 000 μg/L， 其余8 种功能性成分终质量浓度为50、250、1 000 μg/L的混合标准溶液，计算目标化合物在特定质量浓度下的回收率和精密度。表4表明，9 种功能性成分的相对标准偏差均低于6.00%，加标回收率在81.80%～109.30%之间，表明该方法对于检测这9 种功能成分具有很好的准确性和精确性，完全能够满足分析要求。

表4 9 种功能成分的回收率和精密度Table 4 Recoveries and precision RSD for nine functional components

2.4 酒样检测结果

酒厂浓香型、酱香型、芝麻香型和市售浓香型共计20 种白酒酒样的9 种微量功能成分定量分析结果如表5所示，典型酒样的总离子流图见图3。白酒中的萜烯类物质主要来源于两方面：酿酒原料及大曲中含有的萜烯类化合物在微生物的作用下不断溶入酒体；少数底物在某些微生物作用下发生特异性碳原子迁移和骨架重排反应，从而转化成萜烯类化合物[21]。山庄酒厂浓香型酒样的D-柠檬烯质量浓度在2 371.46～2 552.92 μg/L范围内，市售酒样最高也可达到2 456.23 μg/L，酱香型酒样含量不在检测范围内，而芝麻香白酒中未检测到，这可能是由于浓香型白酒用曲量较低，所以较好地保留了来自原料的萜烯类成分[22]。对伞花烃在20 种酒样中均可被检出，市售酒样W17、W19及W20质量浓度分别为27.77、40.80 μg/L及36.88 μg/L，其余17 种酒样皆维持高水平（1 525.85～5 369.18 μg/L）。叶绿醇作为一种二萜类化合物，在酒厂酒样及市售酒样W11～W14和W16中被检出，且在浓香型酒样中含量较其他2 种香型丰富，W01样品中质量浓度高达5 643.23 μg/L。

表5 酒样中9 种功能成分定量结果Table 5 Quantitative results of nine functional components in different Baijiu samples

图3 典型样品的总离子流色谱图 Fig. 3 Total ion current chromatogram of typical Baijiu sample

酚类物质或是由高粱、小麦、大曲等酿酒原料中的单宁、木质素、蛋白质等物质分解而来，或经由发酵过程中微生物直接代谢生成、或是由酿造过程中形成的氨基酸和阿魏酸等中间产物经酵母菌或细菌代谢生成[23]。4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、麝香草酚、异丁香酚是优良的自由基清除剂，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、提高免疫力、阻断致癌物形成等功能[24-25]。 芝麻香型白酒的4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚和异丁香酚质量浓度范围分别为1 153.08～2 086.04、1 202.05～1 273.91 μg/L和752.86～1 013.52 μg/L，显著高于其他香型酒样。Zheng Yang等[22]通过不同香型白酒的香气重组和缺失实验发现，4-乙基愈创木酚在芝麻香型白酒中比重最高且其香味特点突出，香味保留时间长，是名优酒优雅、醇厚等风味的重要因素[26]。麝香草酚在20 种酒样中含量差异较大，其中酒样W11中质量浓度最高，为108.51 μg/L。

20 种白酒中都检测到四甲基吡嗪，但不同香型酒样中含量差异显著。酱香型酒样中四甲基吡嗪含量最高（2 379.65～2 985.09 μg/L）；芝麻香型酒样平均质量浓度也能达到1 183.29 μg/L；浓香型中四甲基吡嗪含量最低至6.83 μg/L。孙啸涛等[27]对67 种白酒的四甲基吡嗪含量分析也有相同结果：酱香型白酒最高质量浓度可达到2 434.3 μg/L，浓香型白酒中四甲基吡嗪最低，仅为1.5 μg/L。酱香白酒酿造采用高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温馏酒，发酵周期长、贮存时间长的“四高两长”工艺，糖与氨基酸在高温酿造过程中发生美拉德反应生成四甲基吡嗪，同时在芽孢杆菌、乳酸菌等微生物作用下，乙偶姻逐渐转化生成四甲基吡嗪，并最终大量累积在酱香白酒酒体中[28]。

亚油酸乙酯随着酒体进入人体后，被水解或酶解成亚油酸，发挥降胆固醇、降血压、抗血栓、抗氧化、抗癌以及提高记忆能力和免疫力等功效[29-30]，除市售酒样W17、W19和W20外，其余酒样中亚油酸乙酯质量浓度为1 951.96～7 183.35 μg/L，与刘奕霏等[18]在5 种市售白酒中检测到的6.2～8.0 mg/L结果基本一致。不同香型白酒大曲、原料及生产工艺大相径庭，亚油酸乙酯含量差异显著。同一种香型的白酒虽然生产工艺相似，但是由于产地、水质、气候等不同，导致同一香型不同品牌白酒具有不同的亚油酸乙酯含量。

3 结 论

GC-MS-SIM方法具有检测快速、准确性高、专一性强等优点，应用该方法对20 种白酒中的9 种微量功能成分定量分析结果表明，3 种萜烯类物质在浓香型酒样中含量较高，且在山庄酒厂酒样中含量普遍高于市售酒样；4 种酚类物质在芝麻香型白酒中含量最高；四甲基吡嗪在酱香型酒样中含量较高，芝麻香型酒样次之，在浓香型酒样中含量最低；亚油酸乙酯在不同香型及不同品牌酒样中含量差异较大，上述研究结果可为白酒微量功能成分研究提供一定数据支持。白酒是中华民族几千年来智慧的结晶和瑰宝，其中的微量功能成分还有很多值得挖掘和研究之处，例如这些功能成分的产生机制、作用机制及酒体中组成成分的结构优化、互相配伍、拮抗机制等，这是中国白酒匠人和学术研究者现阶段甚至未来几十年的研究重点之一，也是中国白酒进一步走向世界的强大助力。