香菇真空冷冻干燥过程中滋味物质动态 变化及鲜味评价

卢晓烁，张毅航，方东路，范 霞，胡秋辉，陈计峦，赵立艳,

（1.南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京 210095；2.石河子大学食品学院，新疆 石河子 832003）

香菇（Lentinula edodes）是常见的食用菌之一，长期以来，其因营养价值高而成为备受消费者喜爱的食物[1]。与此同时，香菇还具有独特的鲜香风味，所以其常被选作食品调味原料[2]。但由于香菇产量大且含水率高，多数采收后的香菇被制成干品以延长其保质期[3]。真空冷冻干燥（vacuum freeze-drying，VFD）是当前常用的一种脱水干燥技术，它虽然在我国食品工业中起步较晚，但近年来发展迅速，其突出优势在于能有效保留食品原有的色香味和营养成分等[4]，故适用于食用菌及其产品的加工[5]。

随着食用菌产业的发展壮大，检测及分析食用菌的风味对评价其品质愈发重要。食品的风味特征涵盖2 个方面，即气味与滋味，前者主要源自挥发性化合物，而后者主要由非挥发性化合物贡献。以往国内外学者对香菇风味物质的研究多聚焦在挥发性成分上，尤以鲜菇及其干品中挥发性化合物的定性和定量分析[6-7]、不同方式干制的香菇中挥发性组分的差异比较[8-10]为主。近年来，不同品种的香菇子实体和市售干香菇中的非挥发性风味物质也被广泛关注[11-13]。据研究，香菇的鲜美口味主要来源于几种水溶性小分子物质，包括可溶性糖（醇）、5’-核苷酸、游离氨基酸和有机酸[14]，它们能有效提高食品的适口性[15]。现如今在滋味属性的评价方面，电子舌越来越受科研人员青睐，因其能模仿人类的味觉感受机制，并高效、准确地评估滋味物质对主要味觉特征的影响[16]。 香菇的非挥发性化合物是其滋味属性的重要组分，然而，关于香菇干制过程中滋味组分的动态变化鲜有研究。因此，为了探究香菇VFD过程中滋味物质的变化规律，本实验对该过程进行跟踪取样，通过电子舌技术确定不同VFD阶段香菇的滋味特征，利用高效液相色谱仪和氨基酸分析仪测定可溶性糖（醇）、呈味核苷酸、有机酸和游离氨基酸，此外，借助等鲜浓度（equivalent umami concentration，EUC）的变化反映鲜味强度的改变。本研究旨在为深入了解VFD过程中香菇滋味物质的变化机制提供理论依据，并指导以香菇为基料的低钠调味品开发。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇（品种：808）购于南京市卫岗苏果超市。

可溶性糖（醇）、核苷酸、有机酸标准品 上海源叶生物科技有限公司；氨基酸混合标准溶液 日本Wako公司；所有分离用有机溶剂均为国产色谱纯。

1.2 仪器与设备

70-2台式切片机 镇江金汇缘食品机械有限公司； LyoBeta 15真空冷冻干燥机 西班牙Telstar公司； SA-402B电子舌 北京盈胜恒泰科技有限责任公司；1200液相色谱仪 美国Agilent公司；L-8900全自动氨基酸分析仪 日立高新技术公司；TDZ5-WS型台式离心机 湖南湘仪仪器开发有限公司；KQ-250DB数控超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司；N-1001旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 VFD工艺流程及操作要点

工艺流程[17]：鲜香菇→预冻→升华干燥（I阶段干燥）→解析干燥（II阶段干燥）→干制品。

操作要点：挑选肉质饱满、大小均匀（菌盖直径约为5.0～5.5 cm）的新鲜且未开伞的香菇，去除部分菌柄（修剪至长度约为1.0 cm），然后清洗、沥水、切片（厚度约5 mm），接着在－30 ℃下预冷冻12 h后，立即将其置于仪器干燥室内进行VFD[18]。设置真空压力为40 Pa；升华干燥温度为10 ℃，解析干燥温度分别为20、30、40 ℃和50 ℃。当水分质量分数降至13%以下[19]时停止干燥。在VFD的每个关键步骤结束时取样，其中新鲜样品、预冻后的样品（SM0）和升华干燥后的样品（SM1）在收集后立即用液氮冷冻并贮存在－80 ℃的超低温冰箱中待用；解析干燥后的样品（4 个温度下分别记为SM2、SM3、SM4和SM5）研磨成粉并过60 目筛，置于干燥器中避光保存待用。

1.3.2 电子舌检测

称取各香菇样品1.000 0 g（以干质量计）于烧杯中，加入40 mL蒸馏水搅拌，然后将其转入离心管中4 000 r/min离心20 min，离心后取上清液定容至100 mL用于电子舌测量[20]。

1.3.3 可溶性糖（醇）的测定

参考Pei Fei等[21]的方法并略微调整，称取各香菇样品0.500 0 g（以干质量计），加入30 mL体积分数为80%乙醇溶液，于60 ℃水浴提取30 min，然后4 000 r/min离心20 min。取出上清液，将残渣用相同的方法反复2 次进行提取。最后合并上清液于旋转蒸发仪中浓缩至干，并随即用75%乙腈溶解定容至10 mL。取溶解液经0.45 μm滤膜过滤后待测。

色谱条件：采用Sugar-D色谱柱（4.6 mm× 250 mm），柱温30 ℃；流动相为超纯水-乙腈（25∶75，V/V），等度洗脱，流速1.0 mL/min；进样量20 μL；采用蒸发光散射检测器；N2流速2.1 L/min；漂移管温度81 ℃。根据标准品的出峰时间及峰面积，绘制标准曲线计算样品中相应物质的含量。结果以干基计。

1.3.4 呈味核苷酸的测定

参照Li Biao等[22]的方法稍作修改，称取各香菇样品0.500 0 g（以干质量计），加入30 mL超纯水，煮沸1 min后冷却，然后4 000 r/min离心20 min。取出上清液，将残渣用相同的方法反复2 次进行提取。最后合并上清液于旋转蒸发仪中浓缩至干，并随即定容至10 mL。取溶解液经0.45 μm滤膜过滤后待测。

色谱条件：Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温25 ℃；流动相为超纯水-甲醇-冰乙酸-四丁基氢氧化铵（894.5∶100∶5∶0.5，V/V）， 等度洗脱，流速0.6 mL/min；进样量20 μL；采用紫外检测器，检测波长为254 nm。根据标准品的出峰时间及峰面积，绘制标准曲线计算样品中相应物质的含量。结果以干基计。

1.3.5 游离氨基酸的测定

称取各香菇样品0.500 0 g（以干质量计），加入质量浓度为10 g/L的磺基水杨酸2 mL和10 g/L的 EDTA-2Na 1 mL，混合均匀后超声处理1 h，静置过夜。用0.02 mol/L盐酸复溶并定容至25 mL，取溶解液经0.45 μm滤膜过滤后待测。采用氨基酸自动分析仪对游离氨基酸进行测定，根据标准品的出峰时间及峰面积计算样品中各游离氨基酸含量[23]。结果以干基计。

1.3.6 有机酸的测定

参考余科林[24]的方法并略微改动，称取各香菇样品0.500 0 g（以干质量计），加入0.01 mol/L的KH2PO4溶液（pH 2.80）10 mL，于45 ℃超声提取30 min。然后4 000 r/min离心20 min，最后取上清液定容至10 mL。取溶解液经0.45 μm滤膜过滤后待测。

色谱条件：采用Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温25 ℃；流动相为KH2PO4（0.01 mol/L，pH 2.80）-甲醇（95∶5，V/V），等度洗脱，流速0.6 mL/min；进样量20 μL；采用紫外检测器，检测波长210 nm。根据标准品的出峰时间及峰面积，绘制标准曲线计算样品中相应物质的含量。结果以干基计。

1.3.7 EUC的计算

EUC常用于表征食品的鲜味强度[25]。它是根据鲜味氨基酸和呈鲜核苷酸计算得到，按下式计算[26]：

式中：EUC按每100 g干样品含谷氨酸钠（monosodium glutamate，MSG）质量计/（g/100 g）；ai为天冬氨酸或谷氨酸含量/（g/100 g）；aj为5’-鸟苷酸或5’-腺苷酸含量/（g/100 g）；bi为每种鲜味氨基酸相对于Glu的值（Glu=1，Asp=0.077）；bj为每种呈鲜核苷酸相对于5’-肌苷酸的值（5’-鸟苷酸=2.3，5’-腺苷 酸=0.18）；1 218为基于单位g/100 g的协同常数。

1.4 统计分析

采用Excel、Origin 95和IBM SPSS Statistics 22软件对数据进行处理和统计分析。其中方差分析采用ANOVA程序，多重比较分析采用LSD法，显著性水平为0.05。每组实验平行测定3 次，结果以±s表示。

2 结果与分析

2.1 电子舌评价

电子舌是根据传感器表面的人工双层脂质膜与呈味物质之间发生的静电作用或疏水作用选择滋味成分，并通过随之发生改变的电势将味道转化为数值形式，从而使传感器的响应量化[27]。电子舌系统由5 个味觉传感器组成，能够检测酸味、苦味、涩味、鲜味和咸味物质。利用电子舌系统评价不同VFD阶段的香菇样品之间的滋味特征差异，结果如图1a所示。与鲜香菇相比，预冻后香菇（SM0）的滋味轮廓变化幅度小，升华干燥后香菇（SM1）的滋味轮廓明显改变，而20、30、40 ℃和50 ℃解析干燥后香菇（SM2～SM5）的滋味轮廓变化程度不同，表明在解析干燥过程中香菇滋味物质的变化受温度影响。此外，在香菇VFD过程中每种滋味特征的变化情况不同，其中最明显的变化是在不同温度的解析干燥后，香菇的酸味、苦味及苦味回味强度增加，这可能与有机酸和苦味氨基酸的含量增加有关。

图1 香菇VFD过程中滋味物质的电子舌分析Fig. 1 E-tongue data of taste compounds in L. edodesduring vacuum freeze-drying

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一种多元统计分析方法，其作用是通过变换和降维，最终以简化的信息反映原始数据[28]。为进一步分析不同VFD阶段香菇间的差异，基于电子舌雷达图反映的评价结果，选择样品中鲜味、咸味、酸味、苦味和苦味回味的电子舌响应值进行PCA，得到PC1和PC2的贡献率分别为71.1%和23.4%，其累计贡献率达94.5%，因超过90%，故这2 个PC能较好地反映原始信息。如图1b所示，对PC1影响最大的是咸味，其次为鲜味，而苦味和酸味对PC2的影响较大。在图1b中，香菇鲜样与预冻后的香菇样品（SM0）分布最集中，更加说明预冻前后香菇的整体滋味特征变化不大。升华干燥后的样品（SM1）与解析干燥后的样品（SM2～SM5）主要沿PC1分离，其中鲜味、咸味、苦味及苦味回味对样品间区分贡献较大。而解析干燥后的样品除SM2外聚集分布，PC2更多地体现出它们之间的差别，尤其是在酸味特征上。

2.2 可溶性糖（醇）变化与分析

香菇含有的可溶性糖（醇）是其甜味的主要贡献者。如表1所示，本实验在不同VFD阶段的香菇样品中共检测到1 种单糖（果糖）和3 种可溶性的糖醇（阿拉伯糖、甘露醇、海藻糖）。在本研究的香菇样品中，阿拉伯糖和海藻糖的含量均比其在陈万超等[13]测定的市售干香菇中低，可能是因为香菇的品种和干燥方式的差异。由表1可知，在香菇的可溶性糖（醇）中，甘露醇含量最高，这一结果同Yang等[29]研究。香菇经预冻后，其果糖、甘露醇和海藻糖的含量显著高于鲜样（P＜0.05），可能是应激反应所致。香菇经升华干燥后，其阿拉伯糖、果糖、甘露醇和海藻糖的含量继续增加，表明该过程有利于香菇内源的可溶性糖（醇）大量释放。随着解析干燥温度的升高，香菇中可溶性糖（醇）的含量逐渐降低，可能是因为在30、40 ℃和50 ℃解析干燥阶段，这3 种样品（SM3～SM5）中阿拉伯糖、果糖和甘露醇与游离氨基酸发生美拉德反应。而受解析干燥温度的影响，香菇中的海藻糖与另外3 种可溶性糖（醇）相比，其含量的波动变化更加明显，这可能与其是一种典型的细胞应激代谢物密不可分[30]。

表1 香菇VFD过程中可溶性糖（醇）含量变化Table 1 Changes in contents of soluble sugars/mannitols in L. edodes during vacuum freeze-drying

2.3 呈味核苷酸变化与分析

5’-核苷酸是香菇中典型的鲜味成分。本实验中共检测到4 种单核苷酸，分别为5’-胞苷酸、5’-腺苷酸、5’-鸟苷酸和5’-尿苷酸，这与于海龙等[11]的研究结果相似。由表2可知，香菇经预冻后，每种核苷酸的含量均显著升高（P＜0.05），这可能是因为样品受细胞破裂的影响，其细胞中的核糖核酸酶可以更加充分地作用于核糖核酸[31]。 样品经升华干燥后，只有5’-胞苷酸含量显著下降 （P＜0.05）且其低于鲜香菇中的含量，而5’-腺苷酸含量显著升高（P＜0.05），由此表明，伴随着水分流失，香菇中各种核苷酸的含量及其比例也在发生变化。香菇经不同温度的解析干燥后，5’-胞苷酸的含量表现出不同程度的上升趋势，并且在20、40 ℃和50 ℃解析干燥后的干香菇（SM2、SM4和SM5）中其含量均显著高于鲜样中的含量（P＜0.05），该结果与于海龙等[11]发现的市售干香菇制作过程中5′-胞苷酸含量上升一致。 5’-鸟苷酸是香菇鲜味的突出贡献者[16]，在30、40 ℃和50 ℃解析干燥后的样品（SM3～SM5）中其含量均多于鲜香菇中的含量，尤其是30 ℃和40 ℃解析干燥后的样品中其含量显著高于鲜样中的含量（P＜0.05）。本实验中所得干制香菇的5’-核苷酸总量增加，该结果与Dermiki等[31]的研究结果相似，表明VFD有利于香菇生成与保留其中大部分呈味核苷酸，特别是当解析干燥温度为40 ℃时效果更佳。

表2 香菇VFD过程中呈味核苷酸含量变化Table 2 Changes in contents of 5’-nucleotides in L. edodes during vacuum freeze-drying

2.4 游离氨基酸变化与分析

如表3所示，香菇鲜样的游离氨基酸总量为33.49 mg/g， 与Xu Lei等[32]报道的新鲜香菇中游离氨基酸总量（31.70 mg/g）相似。不同VFD阶段的香菇中游离氨基酸总量为24.48～44.76 mg/g，其中Thr占比最大（18%～34%），这与于海龙等[11]报道大体一致（Thr占香菇游离氨基酸总量的13%～42%）。由表3可知，香菇预冻前后，各游离氨基酸的含量变化不显著（除Asp、Ala、Cys和Lys）。而经过升华干燥后，样品中大部分游离氨基酸的含量增加，其中甜味氨基酸（Thr+ Ser+Gly+Ala+Pro）、苦味氨基酸（Val+Met+ Ile+Leu+Phe+His+Arg）和无味氨基酸（Cys+Tyr+Lys）含量显著高于鲜样中的含量（P＜0.05）；此时游离氨基酸的总量较高，可能是由于升华干燥阶段蛋白质发生水解。Tian Yuting等[33]在研究干燥方法对香菇质量的影响时发现高温可以促进蛋白质的水解，干燥后香菇的游离氨基酸总量显著增加（P＜0.05）。由于本实验中的干燥方法更加温和，在不同温度的解析干燥阶段，样品中游离氨基酸总量均呈现下降趋势，但它们之间（SM2～SM5）有所差别，其中20 ℃解析干燥后的香菇中游离氨基酸总量显著下降（P＜0.05）并为最小值，而30 ℃和50 ℃解析干燥后的样品中游离氨基酸总量仍高于鲜样。结合上述可溶性糖（醇）的含量变化推测，在解析干燥过程，Ser、Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Phe、His、Arg、Cys、Lys可能与糖发生美拉德反应，致使游离氨基酸总量有降低的趋势，并且降低程度受解析干燥温度的影响。

表3 香菇VFD过程中游离氨基酸含量变化Table 3 Changes in contents of free amino acids in L. edodes during vacuum freeze-drying

2.5 有机酸变化与分析

香菇中有机酸的种类和含量与其滋味形成紧密相关[34]。 而由于香菇的品种和生长环境不同以及有机酸提取方法各异，市售香菇中的有机酸组成及其含量差异较大[35]。本实验选取食用菌滋味评价中6 种常用的有机酸进行测定，结果见表4。在香菇VFD过程中，酒石酸含量呈现出先降低后升高的趋势，苹果酸则相反，而冰乙酸含量持续上升，琥珀酸仅在30、40 ℃和50 ℃解析干燥后含量显著升高（P＜0.05）。柠檬酸的含量变化幅度不大，是因为与其他有机酸相比，其具有良好的热稳定性[36]。Li Xiaobei等[37]研究表明，干燥有利于释放更多的酒石酸和冰乙酸，本研究获得了类似结果。可能是因为随着样品温度的升高，香菇中相关酶被激活，从而极大地促进了有机酸的形成[21]。从有机酸总量看，香菇VFD后其显著增加（P＜0.05）且不受解析干燥温度的影响，这也证明了在电子舌检测时可以利用酸味将解析干燥后的香菇样品与其他样品区分开。

表4 香菇VFD过程中有机酸含量变化Table 4 Changes in contents of organic acids in L. edodes during vacuum freeze-drying

2.6 EUC比较

由于鲜味是食用菌最突出的滋味特征，并且当鲜味氨基酸与呈味核苷酸同时存在时，二者产生的协同效应能显著提高鲜味强度[38]，因此为了进一步全面分析香菇VFD过程中鲜味的变化情况，本研究利用EUC值的变化反映鲜味强度的改变，结果如图2所示。预冻后香菇的EUC值（92.00 g/100 g）有升高的趋势，但与鲜香菇的EUC值（78.96 g/100 g）无显著性差异，表明预冻后香菇的鲜味强度并未显著提高。升华干燥后香菇的EUC值（100.19 g/100 g）进一步增加，并且显著高于鲜样的EUC值（P＜0.05），表明升华干燥阶段有效提高了香菇的鲜味强度。20 ℃解析干燥后香菇的EUC值降至整个VFD过程的最低点，为58.35 g/100 g，并且显著低于鲜样的EUC值（P＜0.05），这是由该阶段香菇中鲜味氨基酸的含量降低导致。而与鲜香菇相比，30、40 ℃和50 ℃解析干燥后香菇的鲜味强度增加了约1 倍，EUC值在149.91～188.66 g/100 g之间，表明适当升高解析干燥温度有利于提高香菇干制品的鲜味强度。

图2 香菇VFD过程中EUC值变化Fig. 2 Changes of EUC values in L. edodes during vacuum freeze-drying

3 结 论

电子舌能有效评价不同VFD阶段香菇间的滋味差异。经高效液相色谱仪和氨基酸分析仪检测发现，香菇的滋味物质在VFD的预冻、升华干燥和解析干燥阶段存在如下的变化规律：鲜香菇经预冻后其可溶性糖（醇）和5′-核苷酸含量均显著增加（P＜0.05）。在升华干燥后，香菇的可溶性糖（醇）和游离氨基酸含量均增加为整个VFD过程的峰值。在解析干燥阶段，香菇的有机酸含量增加且不受解析干燥温度的影响；然而，可溶性糖（醇）和游离氨基酸含量均随温度变化呈现不同的下降趋势，这有待进一步研究是否与美拉德反应有关。

总之，VFD过程能很好地保留香菇中大多数滋味成分，这有利于增强呈味物质之间的协同效应从而丰富香菇的滋味特征。特别是在温度高于20 ℃的解析干燥后，香菇的鲜味强度得到了有效提高。鉴于滋味是评价食品品质的一个重要指标，本研究为深入了解香菇在VFD过程中其滋味物质变化机制提供基础理论，并且可指导以香菇为基料的滋味物质开发提供参考。