基于网络药理学温阳解郁颗粒治疗抑郁症的作用机制研究

史 敏，冯振宇，孟 霜，马小娟，赵建平

（1.山西中医药大学，山西 太原 030619；2.山西省中西医结合医院，山西 太原 030013）

抑郁症（depression）是一种常见的大脑功能紊乱性疾病，患者多表现为自主活动兴趣持续性低落且思维缓慢、呆滞等，严重影响其自主生活能力和身心健康［1］。

中医对抑郁症的研究最早见于《黄帝内经》“郁”的概念，中医相关研究认为情志内伤是诱发郁证的主因素，体内阳气不能支撑生理功能正常运行，神失所养，再加上外界因素的刺激，长期耗伤机体气血津液导致本虚，故抑郁症常表现为虚实夹杂，长期反复发作［2，3］。目前临床上将药物治疗作为抗抑郁治疗的关键且大多数以化学药物为主，通过阻断单一靶点发挥抗抑郁作用，但绝大部分作用缓慢，易产生不良反应，长期服用还会出现明显耐药性［4］。中医药治疗抑郁症则从整体调节出发，利用中药组分多途径、多靶点、多层次的作用特点，对患者进行辩证个体化治疗。近年随着国内外学者不断深入研究，中药单方及复方在治疗不同类型抑郁症方面的临床疗效显著。

从中医角度来看，抑郁症大多以肝气郁结为基础病机，多为机体阳气不足，神失所养而致［5］。温阳解郁颗粒是由郑钦安《医法圆通》之补坎益离丹化裁而来，由桂枝、附子、炙甘草、乌梅、大枣、生姜六味药组成，有复肾阳、补肝阳、暖心阳、运脾阳之功效，能收纳微阳于肾，伏虚火于中，缓解因长期生活压力、精神紧张导致的肾精受损、阳气不足，在临床抗抑郁治疗中取得良好成果［6］。

课题组前期实验发现温阳解郁颗粒能显著改善慢性轻度不可预见应激模型（CMUS）大鼠的抑郁行为，并通过实验进一步验证温阳解郁颗粒可调控CUMS 大 鼠HPA 轴 功 能，改 善 抑 郁 样 行 为［7，8］。但它如何缓减海马组织形态改变以及其具体分子作用机制尚未明确，需进一步实验探究。因此，本文拟通过网络药理学方法建立“药物-成分-靶点”网络图，探讨温阳解郁颗粒治疗抑郁症的分子作用机制，并通过实验验证筛选的抗抑郁主靶点，为深入研究其抗抑郁关键靶点、通路及临床运用研究提供一定数据参考。

1 资料与方法

1.1 温阳解郁颗粒化学成分的收集

利用中药系统药理学分析平台TCMSP［9］（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、化学专业数据库（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）分 别 以“附 子”、“甘 草”、“桂 枝”、“乌 梅”、“生 姜”、“大枣”为关键词检索温阳解郁颗粒组方的化学成分，并通过PubChem 数据库（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取这些化学成分的分子结构，保存为Canonical SMILES 格式。

1.2 活性化学成分的筛选及潜在作用靶点筛选

新药研发领域，类药五原则常被用于新药合成的初筛，符合此规则的化合物有更好的药代动力学性质，更利于机体代谢吸收，成为口服药物的可能性更大。最常见的药物筛选药代动力学参数有生物利用度（OB）和类药性（DL），由于抗抑郁药物需穿越血脑屏障到达大脑相关区域，改善抑郁症状，还应考虑血脑屏障值，故以OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥-0.3 以及类药五原则为筛选条件，确定温阳解郁颗粒的有效活性成分［10-12］。利用Swiss Target Prediction 数据库，输入有效活性成分Canonical SMILES 格式，设置“人类”为研究物种，得到它们的作用靶点，整理去重后得到温阳解郁颗粒的潜在作用靶点。

1.3 疾病靶点筛选

借助OMIM（http：//www.omim.org/）、Gene-Cards、（https：//www.genecards.org/）TCMSP 数据库，以“Depression”为关键词检索，并以Relevance score 为参考值，筛选确定抑郁症的相关基因。

1.4 温阳解郁颗粒抗抑郁有效活性化合物与关键靶点相映射，构建核心靶蛋白作用网络

借 助Cytoscape 软 件（Version 3.6.1，http：//www. cytoscape.org）绘 制“抑 郁 症-温 阳 解 郁 颗粒-有效活性化合物-靶点”网络。分别以药物、疾病、有效活性化合物、潜在作用靶点为Node（节点），四者之间的相互关系为edge（边），利用“Network Analysis”功能并依据节点度值（Degree）进行网络的拓扑属性分析，提取温阳解郁颗粒抗抑郁的核心作用网络，同时选择节点自由度值≥平均自由度的靶 点 蛋 白，导 入String 数 据 库（https：//string-db.org/cgi/input.pL），设置物种为人类、置信度为mediumconfidence=0.4，获取蛋白相互作用关系网络。

1.5 GO 富集分析和KEGG 通路分析

将得到的温阳解郁颗粒的潜在抗抑郁作用靶点导入David 数据库［13］（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/），物种限定“人类”，对靶点进行GO 生物过程（Gene Ontology-biological process）富集分析和KEGG Pathway 富集分析，保存结果，以P＜0.05 为标准筛选其抗抑郁生物过程及信号通路，分析温阳解郁颗粒可能的治疗抑郁症的分子作用机制。

1.6 分子对接

取拓扑分析时度值较高的温阳解郁颗粒核心活性成分和关键靶点利用AutoDock Vina_1.1.2 进行分子对接实验，验证其相互作用活性。具体实验方法：（1）登录TCMSP 网页下载保存核心活性成分3D 结构式，存为“mol 2”格式，利用AutoDock Tools将分子结构分别加氢原子、平衡电荷、能量最小化最后存为PDBQT 格式。（2）在PDB 网页下载关键靶点蛋白的晶体结构，存为“pdb”格式，利用AutoDock Tools 分离其配体、去水、加氢、计算电荷后同样存为PDBQT 格式。（3）调整对接盒子的大小和格点中心，进行分子对接，并对对接结果进行分析。（4）利用PyMOL 软件进行图像化展示。

2 结果

2.1 温阳解郁颗粒有效活性成分

通过TCMSP 数据库、化学专业数据库分别检索温阳解郁颗粒中6 味中药的化合物，得到附子65个、甘草280 个、桂枝220 个、乌梅40 个、生姜265 个和大枣133 个，通过“类药五原则”及OB≥30%、DL≥0.18 和BBB≥-0.3 的筛选条件，但考虑到在药物活性成分筛选时，有一些成分因药代动力学参数较差而被筛除，但其中有些属于药物的主要成分，含量占比丰富，例如桂皮醛、菖蒲烯、香豆精在桂枝中含量较高［14］，次乌头碱、甘草苷等也同样是附子、甘草的主要成分且文献研究广泛，故将它们均添加为温阳解郁颗粒的有效活性成分一起做潜在靶点分析。结果得到温阳解郁颗粒的潜在活性成分：附子8 个、甘草50 个、桂枝7 个、乌梅5 个、生姜4 个，大枣18 个。

2.2 潜在作用靶点预测

通过GeneCard、OMMI 数据库得到抑郁症相关基因靶点11 449 个，通过利用“Relevance score≥10”的条件筛选，最终得到513 个疾病靶点。利用Swiss Target Prediction 数据库得到潜在预测靶点的结果为：附子362 个、桂枝128 个、乌梅151 个、甘草594 个、大枣513 个、生姜139 个。将它们去重后与疾病靶点相映射，绘制韦恩图（图1），并得到温阳解郁颗粒治疗抑郁症的关键靶点基因118 个。同时将附子、甘草、桂枝、大枣、乌梅、生姜六味药的抗抑郁靶点相映射，得到共同抗抑郁基因6 个（图2），进一步说明温阳解郁颗粒通过各药味协同作用，多靶点发挥抗抑郁功效。

图1 温阳解郁颗粒与抑郁症靶点相映射韦恩图Fig 1 Venn map of Wenyang Jieyu Granule and depression target

图2 附子、甘草、乌梅、桂枝、大枣、生姜抗抑郁靶点相映射韦恩图Fig 2 Venn map of anti-depressant target of aconite，liquorice，dark plum，cassia twig，jujube and ginger

2.3 构建“温阳解郁颗粒-有效活性化合物-靶点-抑郁症”网络

将药物活性成分、潜在作用靶点、疾病分别导入Cytoscape 软件进行网络构建，得到“温阳解郁颗粒有效活性化合物-潜在抗抑郁作用靶点”网络，同时用Cytohubbe 插件将节点按自由度值拓扑分析，提取温阳解郁颗粒抗抑郁的核心作用网络（图3），同时映射得到40 个核心靶点及47 个核心成分，部分相关信息见表1。图3 中三角形代表温阳解郁颗粒抗抑郁核心有效活性化合物，椭圆形节点则代表温阳解郁颗粒潜在关键抗抑郁靶点，各节点间连线紧密复杂，进一步体现温阳解郁颗粒多靶点、多组分的抗抑郁治疗优势，度值由大到小则用颜色深浅来体现，颜色越深表示该节点在温阳解郁颗粒抗抑郁机制中越重要，为后续实验验证选取靶点或成分提供依据。

表1 部分温阳解郁颗粒抗抑郁的核心活性成分及映射筛选的靶点信息Tab 1 Core active components and mapping screening for antidepressant of Wenyang Jieyu Granule

图3 “温阳解郁颗粒抗抑郁核心成分-靶点”可视化网络Fig 3 Visual network of antidepressant core components and targets of Wenyang Jieyu Granule

将2.2 中得到的温阳解郁颗粒40 个核心抗抑郁靶点基因输入String 软件中进行分析，剔除游离蛋白，设置物种为人类，置信度为mediumconfidence=0.4，得到蛋白相互作用关系网络（图4）。其节点代表抗抑郁基因蛋白，每条边则表示不同蛋白间相互作用关系，线条越粗则关联度越大。

图4 核心蛋白互作用网络图（PPI 图）Fig 4 Core protein interaction network diagram（PPI）

2.4 GO 生物学过程富集分析

进一步阐明核心靶点相互作用关系，利用DAVID 数据库GO 功能富集分析，得到GO 条目165 个（P＜0.05），选取生物学功能前30 个条目分析主要涉及神经递质受体传导、铵离子结合、突触后神经递质受体活动、G 蛋白偶联神经递质受体活动等过程，见图5。

图5 GO 生物学功能富集分析Fig 5 GO biological function enrichment analysis

2.5 KEGG 通路富集分析结果

KEGG 通路富集分析得到131 条信号通路（P＜0.05），依据count 值筛选出较前30 个条目，主要涉及Neuroactive ligand-receptor interaction（神经活动配体-受体相互作用信号通路，44 个基因）、cAMP signaling pathway（cAMP 信号通路，24 个基因）、Serotonergic synapse（含血清素的神经突触调节信号通路，23 个基因）、Calcium signaling pathway（钙信号通路，19 个基因）、PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt 信号通路、16 个基因）、MAPK signaling pathway（MAPA 信号通路，含13 个基因）、ErbB signaling pathway（ErbB 通路，12 个基因）等，见图6。课题组前期通过旷场实验、强迫游泳实验及夹尾实验，证明温阳解郁颗粒可以显著改善抑郁大鼠自主活动能力及抑郁样行为。相关指标检测结果显示灌胃温阳解郁颗粒后，温阳解郁颗粒组大鼠血清内的5-HT、DA 含 量 较 模 型 组 均 有 明 显 提 高［22］，而CORT、ACHE 水 平 有 显 著 下 调［7，8］。课 题 组 通 过PT-PCR 等试验，证明温阳解郁颗粒可以下调抑郁大鼠CRH 表达，恢复GR 水平减轻抑郁症状，有效调节保护海马组织，影响HPA 轴功能并相应调节相关激素水平。结合网络药理学KEGG 通路分析来看温阳解郁颗粒可以通过有效调节5-HT 等激素水平，刺激并介导Serotonergic synapse 通路（图7）传导，提高Gc 等受体蛋白表达，减缓高水平糖皮质激素对大脑损伤。同时还可看出某些靶点基因在信号传导过程中刺激激活cAMP、PKA、P13K-Akt、MAPK 等其他信号通路，表明温阳解郁颗粒的多种活性成分通过参与多条信号通路，协同发挥抗抑郁疗效。

图6 KEGG 通路富集分析Fig 6 KEGG path enrichment analysis

图7 温阳解郁颗粒抗抑郁Serotonergic synapse 通路相关靶点Fig 7 Related targets of serotonergic synapse anti-depressive pathway in Wenyang Jieyu Granule

2.6 分子对接结果

由“温阳解郁颗粒抗抑郁核心活性成分-靶点”网络拓扑分析结果可知，温阳解郁颗粒抗抑郁潜在活 性 成 分 中，beta-sitosterol、Nuciferin、7-Methoxy-2-methyl isoflavone3 个成分，度值＞27，同时ESR1、ACHE、SLC6A2、MAOA 靶点度值连接数排列靠前。将它们分别进行分子对接实验，并对对接结果（图8）进行分析打分，结果见表2。从表中可以看出Affinity 得分在“-3.25～-10.65”之间，表明beta-sitosterol 等活性成分与ESR1 等关键靶点具有良好的结合力。

图8 贴合口袋结果（每一列依次是beta-sitosterol，Nuciferin，7-Methoxy-2-methyl isoflavone，每一行依次是ESR1，ACHE，SLC6A2，MAOA）Fig 8 Bagging results（beta-sitosterol，Nuciferin，7-Methoxy-2-methyl isoflavone for each column in turn；ESR1，ACHE，SLC6A2，MAOA for each row in turn）

表2 分子对接结果Tab 2 Molecular docking results

3 讨论

从“温阳解郁颗粒抗抑郁核心化合物-靶点”可视化网络图可以看出温阳解郁颗粒47 个核心活性成分作用于40 个抗抑郁关键靶点，相互作用关系复杂，体现中药复方多组分、多靶点作用的特点。据拓扑分析可知β-谷甾醇、豆甾醇、二氢辣椒碱、甘草酚等成分在温阳解郁颗粒抗抑郁疗效中可能有重要作用，但文献检索结果却鲜有数据说明它们与治疗抑郁症有关。而从靶点角度来看，ACHE、ESR1、SLC6A2、MAOAB 度值连接次数均在26 次以上，推测它们是抗抑郁治疗的关键靶点。同时借助分子对接实验验证了活性成分与关键靶点有良好的结合力，同时文献实验研究结果作为辅证证明，柴胡疏肝散［15］、β-细辛醚［16］等可通过抑制ACHE 活性以及通过其可激活nAChRs 介导的多巴胺信号通路，调节相关激素水平，发挥抗抑郁疗效。而ESR1与ER-α 受体结合后可参与脑组织神经递质传递，影响神经营养因子及HPA 轴水平，治疗抑郁症相关症状［17］。而SLC6A2、MAOA、ABCB1 基因多态性常被用来与不同类型的抗抑郁药物疗效比较相关性［18-21］。因此，可推测温阳解郁颗粒通过多种成分协同发挥抗抑郁作用，其关键机制可结合网络药理学得到的温阳解郁颗粒抗抑郁靶点、核心成分等数据进行进一步探索研究。

从GO 富集及KEGG 通路富集分析结果来看温阳解郁颗粒发挥抗抑郁疗效主要涉及神经递质受体传导、铵离子结合、G 蛋白偶联神经递质受体活动等生物过程，参与调控含血清素的神经突触调节、cAMP、PI3K-Akt、MAPA、ErbBs 等131 条 信 号 通路。结合本文KEGG 富集结果中cAMP、Serotonergic synapse 通路分析图可验证动物实验结果，增加对温阳解郁颗粒抗抑郁作用机制推测的准确性，同时表明温阳解郁颗粒多靶点、多条通路交互协同作用的特点，为今后温阳解郁颗粒药效基础及抗抑郁作用机制深入研究提供方向，比如从5-HT、DA 等神经递质代谢出发探究温阳解郁颗粒抗抑郁关键作用靶点；从体外培养细胞层次上具体研究分析温阳解郁对海马神经细胞功能的具体调控作用；分析温阳解郁颗粒多条抗抑郁通路的相互作用等。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法对温阳解郁颗粒的药味化学成分、作用靶点和其抗抑郁通路作用分析进行了探索性研究，从中可以看出温阳解郁颗粒抗抑郁治疗的特点为多组分、多靶点、通路交互、协同作用。但在某些方面存在一定局限，比如利用药代动力学参数筛选活性成分时，某些药物主成分会被剔除，反映出温阳解郁颗粒复方中其他药味也可能存在有效活性成分未被发掘的情况，故后期研究应不断深入与补充，并对现发掘的药物成分进行具体的药效基础研究，增加科学研究的可行性、准确度，为后期课题组对温阳解郁颗粒药味物质基础及作用机制通路验证等具体实验研究提供方向与参考，为中药抗抑郁研究提供思路。