基于TLR4/NF-κB 信号通路探究白茅根对社区获得性肺炎患者的炎性因子及疗效影响

2021-11-04李秋呈贾盼红李少宁熊晓嫚周向东

海南医学院学报 2021年20期

李秋呈，李琪，2，3，贾盼红，李少宁，熊晓嫚，周向东，2，3

（1. 海南医学院第一附属医院呼吸内科，海南海口 570102；2. 急救与创伤研究教育部重点实验室，海南海口 571199；3. 中国医学科学院海岛急救医学创新单元2019RU013，海南海口 571199）

社区获得性肺炎（CAP）指在院外因细菌、非典型病原体、病毒等感染引起的肺部疾患，主要有发热、咳嗽、咳痰、伴或不伴有胸痛等症状［1］。目前临床上以抗生素为主要治疗手段，随着抗生素滥用，耐药现象日趋严重，治疗疗效降低，甚至危及患者生命。因此亟需寻求新的治疗手段，改变当前窘局。中草药的开发无疑是优选途径之一。白茅根又称茹根、地筋等，是传统中药之一；具有凉血止血、清热利尿等功效，可用于治疗热病烦渴、肺热咳嗽等［2］。其主要成分有糖类、三萜类和黄酮类，相关研究显示［3，4］：糖类为其主要活性成分，具有调节机体的免疫功能；三萜类具有抗炎、抑菌等功效；此外，黄酮类具有抗氧化、抗炎、抑菌及免疫调节等作用。病原体入侵机体可引起大量炎性因子及自由基等毒性因子的形成，大量自由基的积累，可攻击细胞生物膜引起脂质氧化反应，进一步造成组织细胞损伤，在肺部感染中自由基的形成可加重肺泡细胞、肺毛细血管内皮细胞的损害，影响疾病预后。翁梁等［5］研究示白茅根中黄酮类物质具有清除氧自由基能力，表明其具有抗氧化能力。超氧化物歧化酶是机体重要抗氧化酶，可清除自由基，保护细胞避免自由基损伤，相关研究提示白茅根通过提高超氧化物歧化酶活性，达到清除自由基作用，提高抗氧化能力［6］。TLR4（Toll 样受体4）是TLR 受体超家族成员之一，能识别感染因素并进一步激活免疫炎症信号通路［7］。TLR4/NF-κB 信号通路接受多种因素刺激而激活，介导TNF-α 和IL-6 等促炎因子的转录以及各种趋化因子的产生，信号通路的过度表达可引起炎症因子大量释放，加重组织损伤［8］。郭黎等［9］通过肺炎小鼠模型探究发现肺部感染的发病机制与NF-κB 通路激活相关，通过抑制该通路激活，可明显改善肺炎小鼠肺组织病理状态，调节其炎症反应水平。目前李昌灵等［10］研究示白茅根提取物对革兰阴性/阳性菌、真菌均有抑制作用，且细菌疗效较真菌作用强，但未对其抗炎相关机制进行阐述。本研究通过检测超敏C 反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、IL-6、IL-8、TNF-α 及TLR4/NF-κB mRNA 表达水平，旨在探讨白茅根对社区获得性肺炎患者的疗效及对TLR4/NF-κB 信号通路的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019 年11 月～2020 年9 月于海南医学院第一附属医院呼吸内科诊治的120 例社区获得性肺炎患者，采用随机法将受试者分为试验组及对照组。对照组60 例，男性32 例、女性28 例；年龄35～76 岁，平均（56.16±1.21）岁；病程2～4 周，平均（3.57±0.17）周；试验组60 例，男性29 例，女性31例；年龄33～77 岁，平均（55.78±1.35）岁；病程2～4周，平均（3.36±0.25）周。两组资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 纳入、排除标准

诊断标准：患者均符合中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016 年版）中相关诊断标准［11］。（1）急性起病，伴有发热、咳嗽、咳痰等症状；（2）胸部体格检查提示有干湿性啰音；（3）血清学检查示感染指标异常（如白细胞数＞10×109/L）；（4）影像学提示片状、斑片状、网格状等炎性浸润性阴影，伴或不伴胸腔积液；满足以上（1）～（3）项中任意1 项加第（4）项。

纳入标准：（1）符合上述CAP 诊断标准；（2）与医务工作人员沟通无碍；（3）年龄＞18 岁；（4）签署知情同意书。

排除标准：（1）合并肺结核、支气管扩张、肺部肿瘤、免疫缺陷等疾病患者；（2）妊娠及哺乳期女性；（3）意识不清或精神障碍者；（4）对中药制剂过敏者。

1.3 方法

1.3.1 仪器与试剂酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；低温高速离心机（美国Beckmancoulter 公司）；TRIzol 试剂盒、SYBR Green PCR 试剂盒及反转录试剂（美国英杰生命技术有限公司）；PCR 仪器（美国ABI 公司）；白茅根（海南医学院第一附属医院中药房）；头孢呋辛钠、左氧氟沙星（悦康药业集团有限公司）。

1.3.2 实验方法中药制备：称取白茅根30 g，洗净，衡量400 mL 水，分别置入砂锅中煮沸煎至200 mL 时，过滤药渣，待煎剂放置恒温时存入密封袋中保存；标本采集：入院时分别抽取两组静脉血4 mL，待治疗14 d 后，再次抽取两组静脉血4 mL，两次标本均使用离心机以3 000 r/min 速度离心15 min，按照ELISA 试剂盒相关说明进行检测IL-6、IL-8、TNF-α；CRP、PCT 可由本院检验科检查结果获悉；Toll 样受体4（TLR4）mRNA 及NF-κB mRNA 的表达水平测定：采用Trizol 分离提取外周血单核细胞总RNA，依据反转录试剂盒相关方法操作获得cDNA，并根据SYBR Green PCR 试剂盒说明书操作进行Q-PCR。在荧光定量PCR 仪上运用溶解曲线验证PCR 扩增产物的形成，选用GAPDH 为内参基因，两组病例样本TLR4/NF-κB mRNA 的相对表达量为2-ΔΔCt。

1.3.3 治疗方法试验组：白茅根煎剂（200 mL，2付/d）＋头孢呋辛钠针（750 mg，3 次/d）+左氧氟沙星注射液（500 mg，1 次/d）静脉滴注治疗；对照组：头孢呋辛钠针（750 mg，3 次/d）+左氧氟沙星注射液（500 mg，1 次/d）静脉滴注治疗，两组均治疗14 d。

1.3.4 疗效判断（1）比较两组发热、咳嗽消退时间，胸部CT 炎症吸收时间；（2）比较两组疗效效果参照《中药新药临床研究指导原则》相关标准［12］。痊愈：发热、咳嗽、咳痰症状及胸部体征完全消失，感染指标正常，影像学示炎症完全吸收；好转：发热、咳嗽、咳痰症状、体征明显减轻，感染指标较前改善，胸部CT 示炎症部分吸收；无效：持续存在发热、咳嗽、咳痰等症状或症状体征、感染指标、影像学检查较前加重。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 两组症状、胸部CT 改善时间比较

试验组发热、咳嗽、咳痰消退时间及胸部CT 炎症吸收时间均较对照组缩短，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组症状、胸部CT 改善时间比较（d，n=60，±s）Tab 1 Comparison of improvement time of symptoms and chest CT between the two groups（d，n=60，±s）

组别对照组试验组t P发热消退时间3.73±0.24 2.12±0.14 2.731＜0.05咳嗽、咳痰消退时间6.23±0.12 4.54±0.17 3.247＜0.05胸部CT 显示炎症吸收时间10.72±0.22 8.21±0.11 3.175＜0.05

2.2 两组治疗后治疗效果比较

试验组总有效率（96.67%）高于对照组总有效率（85.00%），差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组治疗后治疗效果比较［n=60，n（%）］Tab 2 Comparison of curative effects between the two groups after treatment［n=60，n（%）］

2.3 两组血清CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α 水平比较

治疗前两组血清CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α水平，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后两组CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α 均较前降低，且试验组较对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 两组血清IL-6、IL-8、TNF-α、CRP、PCT 比较（n=60，±s）Tab 3 Comparison of serum IL-6，IL-8，TNF-α，CRP，PCT between the two groups（n=60，±s）

注：与同组治疗前比较，*P＜0.05。

组别对照组试验组PCT(ng/mL)1.77±0.17 0.74±0.24*1.83±0.23 0.35±0.11*0.085 3.386＞0.05＜0.05 t P时间治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后IL-6(pg/mL)76.15±5.18 40.18±6.09*76.47±6.71 21.24±5.21*0.149 3.527＞0.05＜0.05 IL-8(pg/mL)54.08±8.17 31.64±2.11*54.16±10.22 22.41±3.02*0.091 3.247＞0.05＜0.05 TNF-α(pg/mL)73.42±4.23 43.28±9.51*73.74±3.58 26.64±8.69*0.133 3.437＞0.05＜0.05 CRP(mg/L)54.13±7.42 12.35±2.13*53.61±7.25 8.85±1.38*0.174 3.051＞0.05＜0.05

2.4 TLR4/NF-κB mRNA 表达水平比较

治疗前两组TLR4/NF-κB mRNA 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后两组TLR4/NF-κB mRNA 表达水平均较前明显降低，且试验组较对照组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 两组TLR4／NF-κB mRNA 表达水平比较（n=60，±s）Tab 4 Comparison of TLR4/NF-κB mRNA expression levels between two groups（n=60，±s）

注：与同组治疗前比较，*P＜0.05。

组别对照组试验组NF-κB mRNA 1.17±0.27 0.53±0.18*1.18±0.31 0.27±0.07*0.103 3.158＞0.05＜0.05 t P时间治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后TLR4 mRNA 1.36±0.21 0.57±0.15*1.33±0.17 0.26±0.09*0.131 3.287＞0.05＜0.05

3 讨论

20 世纪末由世界卫生组织公布的一项关于肺部感染相关资料显示，社区获得性肺炎发病率最高［13］。CAP 主要好发于老年患者，可能与其纤毛运动能力减弱、肺泡弹性差有关，气道黏液无法及时排除，病情迁延，合并多种感染时，病死率增高。据国内外多项研究［14，15］：目前中国老年CAP 病死率约5%～15.4%，且病死率与年龄呈相关关系，其中重症肺炎患者病死率约45.3%。感染引起的全身炎症反应，亦是增加病死率主要原因之一。所以选择合适抗生素，控制炎症反应、杀灭病原菌，是改善预后的主要干预手段。近年，随着抗生素的广泛使用，病原菌发生结构突变，耐药性日趋严重，CAP 发病率逐年上升，其耐药性亦逐渐增强［16，17］。病原体表面的脂多糖成分可通过激活NF-κB，启动TNF-α、IL-8 及IL-17 的转录翻译，激发“炎症瀑布效应”［18］。炎症反应的大量炎症因子释放时，可进一步对机体组织、器官造成影响。糖皮质激素作为抗炎的常用药物，可显著调节炎症反应，但在伴发感染时可引起感染进一步恶化、加重病情。而中药具有广泛的抑菌效果、调节机体免疫功能、耐药率低、疗效显著等特点，使其成为抗菌药物开发的热点之一，并在抑制炎症反应过程中具有其独特优势。中西药联合使用可有效抑制机体炎症反应，改善病人预后。

中医将社区获得性肺炎归类于“风湿肺热”范畴，因风热外邪袭肺，肺失宣降，导致脏腑功能失调，以发热、咳嗽、咳痰为主要表现，因此宣肺热化痰为主要治疗方法［19］。机体的炎症反应过程亦是对病原体的抵御机制，炎症过程的启动由免疫细胞的模式识别受体（PRR）识别病原体相关分子模式（PAMP）介导，PRR（Toll 样受体等）介导细胞内信号传导，诱发炎症因子、促炎细胞因子的释放［8］。TLR4 是一种重要的模式识别受体，以PAMP 识别配体，如革兰阴性菌细胞壁的脂多糖（LPS）、细菌内毒素等，活化后通过MyD88 依赖性途径或TRIF 依赖性途径激活NF-κB，引起炎症因子释放，对炎症信号起到级联放大效应［20］。研究表明肺部感染患者外周血中TLR4 处于高表达状态［21］。NF-κB 是重要的转录调节因子，其与细胞周期进程、炎症反应以及多种疾病发生进展密切相关。NF-κB 通路包括经典与非经典途径，炎症及免疫反应可激活NFκB，继而NF-κB 通路相关分子转移至细胞核中并刺激或抑制相关基因转录［22］。NF-κB 经典通路是各种PRR 引发信号传导的共同通路，通过NF-κB 通路的激活介导TNF-α、IL-和IL-6 等促炎细胞因子的转录以及各种趋化因子的产生［23］。本研究结果显示：试验组总有效率、发热、咳嗽、咳痰消退时间、胸部CT 炎症吸收时间均较优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示白茅根对CAP 具有显著疗效，短时间内可明显改善患者症状；两组治疗后血清CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α 及TLR4/NF-κB mRNA 等指标较治疗前明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），且试验组较对照组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），提示白茅根通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路活化，减少炎性介质释放，调节炎症反应，减轻炎症因子对肺泡毛细血管屏障的损伤，改善患者症状。蒋崇荣等［24］通过使用白茅根作用SD 大鼠脓毒血症模型，发现白茅根能通过调节细胞核NF-κB p65 的表达，减轻炎症反应及肺泡毛细血管损伤；陈兰英等［25］使用白茅根作用于阿霉素肾病大鼠，发现其通过抑制NF-κB 活化，抑制肾小球纤维化，达到改善肾功能等功效。相关研究均提示白茅根可抑制NF-κB 通路激活，改善疾病进展，与本研究结果相似。

综上，白茅根治疗CAP 具有降低血清CRP、PCT、IL-6、IL-8、TNF-α 水平等功效，其机制与通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路的激活相关，达到下调炎症因子释放作用，改善临床症状。本研究不足之处在于白茅根在社区获得性肺炎中的多靶点、多环节作用机制尚未明确，且需使用TLR4/NF-κB 通路阻断剂明确其具体分子机制，为中草药在治疗社区获得性肺炎的研发中提供理论基础。