传染性单核细胞增多症患儿miRNA-146a 和IRF-3 的表达及临床意义

朱亮华，庄丽丽，金 蕊

（南京医科大学第一附属医院儿科，江苏南京 210029）

EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）广泛感染，全世界约95%的人在某个阶段都会感染，感染后通常无明显症状，若累及单核巨噬细胞，可导致传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis，IM）。有文献指出，约有50%感染EB 病毒的儿童可发展为IM［1］。干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF-3）属于IRF 家族成员之一，是负责对Ⅰ型干扰素（interferon，IFN）信号传导的转录因子，可参与细胞的应激反应，包括抗病毒，DNA损伤和死亡受体信号等［2］。2020 年新型冠状病毒肺炎诊治指南推荐IFN-α 作为抗病毒药物之一。微小mRNA（miRNA）是一类长约22 个核苷酸的非编码RNA，通过调节mRNA 转录及转录后水平，在炎性反应、自身免疫病和肿瘤中发挥重要的作用［3］。IM患儿外周血单核细胞中IRF-3 及miRNA 的表达水平是否改变，miRNA 是否参与调控传单病人中IRF-3 及IFN-α/β 尚不清楚。因此，本研究通过RTPCR 实验检测IM 患儿外周血单核细胞中IRF-3 和miRNA-146a 的表达水平，过表达及干扰miRNA-146a 后检测IRF-3 RNA 和蛋白表达水平变化，为进一步探讨miRNA-146a 参与EB 病毒调控IM 患儿IRF-3基因表达的机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选 取2017 年1 月～2018 年12 月 在 南 京 医 科 大学第一附属医院（江苏省人民医院）儿科住院的45例IM 患儿作为研究对象，患儿符合《诸福棠实用儿科学》第八版中IM 的诊断标准［4］，年龄1～13 岁，平均（5.76±3.05）岁，男性25 例，女性20 例。选取同期门诊健康体检的34 例儿童作为对照组，年龄2～12 岁，平均（6.03±2.69）岁，男性18 例，女性16 例。两组儿童年龄（t=0.415，P=0.339）和性别比例（χ2=4.000，P=0.261）差异无统计学意义，有可比性。

所有资料来自于南京医科大学第一附属医院（江苏省人民医院），儿童监护人均签署书面知情同意书。本研究得到南京医科大学第一附属医院（江苏省人民医院）机构研究伦理委员会的批准。

1.2 材料

HeLa 细胞系由儿科实验室保存；Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）（Gibco，苏州）；胎牛血清（BI，以色列）；青霉素-链霉素双抗（碧云天，上海）；PBS 缓冲液（森贝佳，南京）；Dimethyl Sulfoxide（DMSO）（Amresco，美国）；胰蛋白酶（碧云天，上海）。TRIZOL（Invitrogen，美国）；异丙醇（南试，南京）；无水乙醇（南试，南京）；DEPC 水（碧云天，上海）；氯仿（南试，南京）；逆转录试剂盒（Takara，上海）；甲醇（南试，南京）；BCA 蛋白浓度试剂盒（碧云天，上海）；SDS-PAGE 凝胶试剂盒（碧云天，上海）；蛋白Maker（Thermo，美国）；LipofectamineTM3000（Invitrogen，美国）；ECL 发光液（Thermo Sciemtific，美国）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗、抗IRF-3 抗 体（Sant cruz 公 司，美 国），miRNA-146a mimic，miRNA-146a inhibitor 及 对 照（锐 博 公 司，广州）。

1.3 方法

1.3.1 细胞复苏 从液氮中将冻存的HeLa 细胞取出后，将其置入37 ℃水浴锅中摇晃至充分溶解，加入4 mL 完全培养基至10 mL 离心管中，将上步中的细胞混悬液轻轻打入离心管，1 000 r/min 离心3 min。取出离心管，弃去上清液，加入1 mL DMEM完全培养基，轻轻吹打10 下，置于含7 mL 完全培养基的10 cm 培养皿中，轻轻呈米字型摇晃培养皿，使细胞均匀生长，然后将培养皿置于37 ℃5% CO2培养箱中。

1.3.2 细胞传代 室温预热PBS、完全培养基和胰酶，取出待传代的细胞（细胞密度约为85%～90%），弃 上 清，用3 mL PBS 洗 涤 细 胞2 次，加入2 mL 胰酶，放置培养箱中消化3 min 后，轻轻拍打培养皿侧壁。随后，在显微镜下对细胞进行观察其是否消化完全，若完全消化则加入4 mL 完全培养基进行终止胰酶消化，将液体转移至另一根离心管中，1 000 r/min 离心3 min 后，弃上清后加入3 mL完全培养基，轻轻吹打10 下充分混均匀，然后按比例转移至培养皿中，放入培养箱中培养。

1.3.3 细胞转染 根据LipofectamineTM3000 使用说明书进行转染。将Hela 细胞接种到12 孔板中（1.5×105/孔），待细胞增长至60%～70%时进行转染。每次转染3 个复孔。

1.3.4 制备模板cDNA 分别收集两组儿童外周血2 mL，加入2 mL Ficoll，室温下500×g离心20 min，小心吸取第二层环状乳白色环状淋巴细胞层，依次按步骤加入氯仿、异丙醇、乙醇、DEPC 水，用分光光度计（onedrop）检测RNA OD 260/280 值并记录，按照Takara 公司说明书，逆转录成cDNA，-20 ℃保存待用。

1.3.5 引物设计与合成 根据GenBank中IRF-3和miRNA-146a基因序列设计RT-PCR引物。GAPDH和U6为内参，由上海英骏生物有限公司合成；IRF-3上游引物：GTCGATCAAAAAGAAAGCCCCAGCG，下游引物：CATCCTGCCGTAGGCCGTGCTTCC。GAPDH上游引物：AGGTCGGAGTCAACGGAT ，下游引物：TCCTGGAAGATGGTGATG。miRNA-146a 上游引物：ACACTCCAGCTGGGCCTCTGAAATTCAGTT，下游引物：TGGTGTCGTGGAGTCG。U6上游引物：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.3.6 RT-PCR 反应 根据Biomake 制造商说明书，配置反应体系如下：试剂名称：2x SYBR green qPCR master mix，使 用 量：5 μ L；上 游 引 物（10 μ mol/L），使用量0.4 μL；下游引物（10 μmol/L），使用量：0.4 μL；ddH2O，使用量：3.2 μ L；cDNA，使用量：1 μL。

用LightCycler480Π 仪器将上述体系进行扩增，扩 增 程 序 为：95 ℃5 min；95 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 个循环；95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s；将GAPDH或U6基因用作标准化标准，确认溶解曲线和扩增曲线，并通过比较CT 法计算相对表达水平。

1.3.7 蛋白免疫印迹 将6 孔板的HeLa 细胞用PBS 洗涤一次，取500 μL 胰酶消化，加入1.5 mL 完全培养基终止消化，离心弃上清液，并加入250 μL蛋白裂解液；将细胞裂解混合物置于涡旋仪上涡旋10 s 后冰浴10 min，重复3 次，以12 000 r/min 离心10 min，上清液即细胞总蛋白。蛋白样品浓度检测根据BCA 试剂盒说明书操作。配制10%分离胶，5%浓缩胶，依次进行上样、电泳、转膜、封闭、一抗4 °C 过夜孵育、洗膜、二抗室温孵育1 h、洗膜、显影。

1.4 统计学处理

实验数据使用统计学软件GraphPad Prism 7 和SPSS 22.0 进行统计分析处理。数据表示为平均值±标准误差(±SEM)，并且至少重复3 个独立的实验。两组性别比较采用卡方检验，组间比较采用LSD-t检验进行处理，相关性分析采用Pearson 相关分析。P＜0.05 视为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组儿童外周血中IRF-3 和miRNA-146a 表达水平的比较

Real-time PCR 检测IM 患儿中IRF-3 mRNA的表达较健康对照组表达下降了61%（t=30.340，P＜0.001），见表1。 IM 患儿外周血miRNA-146a的表达较健康对照组增加了1.63 倍（t=34.659，P＜0.001），见表1。

表1 两组IRF-3 及miRNA-146a 表达水平(±SEM)Tab 1 Expression levels of IRF-3 and miRNA-146a in two groups (±SEM)

表1 两组IRF-3 及miRNA-146a 表达水平(±SEM)Tab 1 Expression levels of IRF-3 and miRNA-146a in two groups (±SEM)

组别例数IRF-3 表达水平miRNA-146a 表达水平健康对照组IM 患儿组34 45 t P 1.07±0.11 0.42±0.08 30.340＜0.001 1.05±0.11 2.76±0.27 34.659＜0.001

2.2 IRF-3 和miRNA-146a 表达水平的相关性分析

IM 患儿外周血中IRF-3 和miRNA-146a 的表达水平呈负相关（r=-0.960，P＜0.05），见图1。

图1 IRF-3 和miRNA-146a 表达水平的相关性Fig 1 Correlation between the expression levels of IRF-3 and miRNA-146a

2.3 过表达miRNA-146a 及其抑制剂对IRF-3 mRNA 水平的影响

分别转染miRNA-146a mimic（75 nmol/L）及其 抑 制 剂miRNA-146a inhibitor（150 nmol/L）在HeLa 细胞中，使用Real-time PCR 检测IRF-3 mRNA。与对照组（mimic control）相比，miRNA-146a mimic 组IRF-3 mRNA 的表达明显降低（t=8.270，P＜0.001），见表2。 而miRNA-146a 抑制剂组IRF-3 mRNA 的表达较对照组（inhibitor control）明显升高（t=8.582，P＜0.001），见表3。

表2 miRNA-146a 过表达对IRF-3 mRNA 表达的影响(±SEM )Tab 2 Effect of overexpression of miRNA-146a on IRF-3 mRNA expression(±SEM)

表2 miRNA-146a 过表达对IRF-3 mRNA 表达的影响(±SEM )Tab 2 Effect of overexpression of miRNA-146a on IRF-3 mRNA expression(±SEM)

组别mimic control miRNA-146a mimic t P IRF-3 mRNA 表达水平1.03±0.06 0.49±0.07 8.270＜0.001

表3 miRNA-146a 抑制剂对IRF-3 mRNA 表达的影响(±SEM)Tab 3 Effect of miRNA-146a inhibitor on IRF-3 mRNA expression (±SEM)

表3 miRNA-146a 抑制剂对IRF-3 mRNA 表达的影响(±SEM)Tab 3 Effect of miRNA-146a inhibitor on IRF-3 mRNA expression (±SEM)

组别inhibitor control miRNA-146a inhibitor t P IRF-3 mRNA 表达水平1.01±0.05 1.52±0.07 8.582＜0.001

2.4 过表达miRNA-146a 及其抑制剂对IRF-3 蛋白水平的影响

分别转染miRNA-146a mimic（75 nmol/L）及其 抑 制 剂miRNA-146a inhibitor（150 nmol/L）在HeLa 细胞内，通过Western blot 法对IRF-3 蛋白表达水平进行检测，结果表明miRNA-146a mimic 组（0.72±0.01）较对照组（1.22±0.02）IRF-3 的表达明 显 下 调（t=46.170，P＜0.001），见 图2A。而miRNA-146a inhibitor 组（1.48±0.02）较 对 照 组（0.89±0.01）IRF-3 蛋 白 的 表 达 明 显 上 调（t=25.891，P＜0.001），见图2B。

图2 miRNA-146a 过表达（A）及抑制剂（B）对IRF-3 蛋白表达的影响Fig 2 Effect of miRNA-146a overexpression（A）and inhibitor（B）on IRF-3 protein expression

3 讨论

传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis，IM）是一种自限性疾病，以喉咙痛、颈淋巴结肿大、疲劳和发热为临床特征，但可合并肺炎、心肌炎、血小板减少、中性粒细胞减少等并发症，部分患者可能表现为慢性活动性EBV（CAEBV）。CAEBV 的患者通常表现出在IM 期间出现的体征，如发热、淋巴结病、脾肿大和肝炎，并且血液中EBV DNA 的水平显著升高。较不常见的是，患者也可能出现EBV 相关的噬血细胞综合征或EBV 相关的噬血细胞淋巴组织细胞增生症（HLH），该病3 年生存率仅为60%［5］。固有免疫反应对于维持免疫稳态和消灭入侵病原体至关重要，这涉及多种信号通路调节和翻译后修饰。IRF3 可诱导IFN-I 产生，对于先天性抗病毒反应至关重要。2019 年末开始肆虐全球的新型冠状病毒（2019-nCoV）肺炎，重症患者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、脓毒性休克、顽固性代谢性酸中毒和难以控制的出凝血功能障碍，多版本国家临床诊治指南均将IFN-α 作为新冠肺炎抗病毒治疗药物之一。有文献报道［6］，重组人干扰素α1b 辅助阿昔洛韦治疗可以有效改善IM 患儿免疫功能，降低机体炎症反应，减轻心肌损伤。微小RNAs（miRNAs）是一种约22 bp 的非编码RNA，它具有内源性的单链进化保守序列，通常作为一种内源性的基因表达抑制剂，通过抑制mRNA 的降解和翻译，在许多生物学过程中发挥多种功能，包括自身免疫反应、信号传导、炎症等。EB病毒感染致IM 患儿体内IRF-3 及miRNA 的表达水平及其相关性如何，miRNA 是否参与调控EB 病毒感染病人中IRF-3 及IFN-α/β 尚不清楚。

本研究通过检测IM 患儿和健康对照儿童外周血中miRNA-146a 的表达水平，结果表明两组存在明 显 差 异，这 与Ning［7］，Hatton 等［8］，Boosani 和Agrawal［9］的 研 究 结 果 相 同，EB 病 毒 诱 导 成 人 机 体产生miRNA21、23、24、27、34、146a、155。实验组患儿外周血中检测的IRF-3 表达水平低于健康儿童。相关性分析显示，miRNA-146a 与IRF-3 表达呈显著负相关关系，这表明EB 病毒越高，IRF-3 水平则越低，反之则越高，两者相互影响，参与疾病的进展。通过体外实验证明，在HeLa 细胞中，过表达miRNA-146a 及其抑制剂对IRF-3 mRNA 水平有影响，检测到IRF-3mRNA 及蛋白水平均有显著降低和升高。证实在EB 病毒下调IM 患儿IRF-3基因的表达过程中，miRNA-146a 可能发挥重要作用并参与IM 的发病。EB 病毒潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，Lmp1），可 通 过NF-κB 途 径 导 致miRNA-155 表达提高，同时还能与其靶向结合，导致免疫信号通路中IKKε、SHIP1、MyD88 等因子出现异常表达，这表明EB 病毒具有调控人体miRNA表达，进而破坏人体免疫功能的作用［10-13］。miRNA-146 家 族 包 括miRNA-146a 和miRNA-146b，上 述2个成员靶基因基本相同，主要定位于人体5 号染色体与10 号染色体中，但两者在3，末端核苷酸存在一定区别［14］。大量研究表明，miRNA-146a 与人体免疫应答存在明显关系，其不仅能通过作用于TLRs，如TLR2、TLR4、TLR5/MyD88/NF- κB 通 路 和RIG-I 通 路 中 的 主 要 因 子 的TRAF6、IRAK-1 和IRAK-2，对人体免疫起到负向调控的作用［15-17］，还具有通过miRNA-146a 抑制转录因子活化蛋白1 活性，从而降低人体白细胞介素2 的表达，起到抑制T淋巴细胞的增生的作用；此外还可通过抑制Fas 表达，起到阻止结构域蛋白的合成，让T 淋巴细胞发生活化，最终诱导细胞死亡［18］。miRNA-146a 在人体免疫功能中起到了举足轻重的作用，其在人体发生免疫性疾病或是肿瘤疾病中作用也被证实。有研究表明，系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单核细胞中miRNA-146a 表达下调，引起外周血单核细胞中Ⅰ型干扰素（IFN）表达下降，同时miRNA-146a表达水平与SLE 疾病活动指数评分及IFN 评分呈负相关，这表明miRNA-146a 能靶向作用于IRF-5，从而起到让TRAF6 和IRAK1 直接抑制Ⅰ型IFN 调控通路，达到相应的靶向作用。所以，我们推测miRNA-146a 有 望 成 为SLE 患 者 治 疗 的 新 靶 点［19］。其它研究指出，甲状腺癌患者中miRNA-146a 表达上调，乳腺癌中高表达的miRNA-146a 可负向调控TRAF6、IRAK1、NF-κB 等，这进一步证实miRNA-146a 可作为治疗部分肿瘤疾病的新靶点［20］。还有，在丙型肝炎中当miRNA-122 表达上调时，可起到防止HCV-RNA 降解的作用；服用miRNA-122 抑制药物的患者，其miravirsen 在治疗后能有效地降低HCV-RNA 的表达水平，同时患者耐药性较低，表明miRNA 靶向治疗EB 病毒相关疾病有显著成效［21，22］。EB 病毒不仅在儿童IM 疾病中起到重要作用，同时在鼻咽癌［23］、淋巴瘤［24，25］等肿瘤疾病的发病中扮演重要角色，而IRF 具有抑制EB 病毒于肿瘤的作用，且两者呈现负相关关系，这为后续临床研究病毒相关疾病的治疗提供帮助。

综上所述，鉴于miRNA-146a 与IRF-3 表达呈负相关性，后续重点研究miRNA 能否成为EB 病毒相关肿瘤疗效评价指标，以及进一步探讨EB 病毒相关肿瘤病人中miRNA-146a 对IRF-3 基因的调控及其机制，为将来miRNA 靶向治疗EB 病毒相关疾病提供帮助。

作者贡献度说明：

朱亮华：负责临床标本收集，细胞实验，撰写文稿；庄丽丽：负责统计学分析；金蕊：负责总体实验设计，数据分析。