淫羊藿苷通过AMPK/mTOR 信号抑制自噬减轻糖尿病心肌肥厚研究

吴 冰，张 莲，郭 烽

（中国人民解放军联勤保障部队第940 医院老年科，甘肃 兰州 730050）

糖尿病发病率逐年升高，而心脏并发症是糖尿病患者死亡的主要原因之一，主要表现为心脏充盈受损，舒张功能下降，心肌肥厚和纤维化，称为糖尿病心肌病（diabetes acrdiomyopathy，DCM）。最新研究发现，糖尿病患者心肌自噬活性增加［1］，而细胞自噬与心肌肥厚关系密切［2］。

淫羊藿苷（Icariin）是淫羊藿的主要活性成分，具有改善性功能、抗衰老、抗炎、减轻缺血损伤等作用。Icariin 能通过不同的信号通路调节自噬，且能减轻心肌纤维化［3］和心脏重构［4］。然而，Icariin 能否通过调节自噬改善糖尿病心肌肥厚，国内外未见相关报道。因此，本研究拟构建糖尿病小鼠动物模型，观察Icariin 对糖尿病心肌肥厚的影响并探究相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

雄性C57BL/6 小鼠购自联勤保障部队第940医院实验动物中心。链脲佐霉素（Streptozocin，STZ）、Icariin、mTOR 抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）购自Sigma 公司；Beclin1、微管相关蛋白1 轻链-3B（MAP1LC3B，LC3B）、磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）（#2532）、磷酸化的AMPK（p-AMPK）（#2531）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）（#2983）、磷酸化的mTOR（p-mTOR）（#5536）抗体购自Cell Signaling Technology 公司；β-肌动蛋白（β-actin）抗体及荧光标记的二抗购自北京康为世纪生物科技有限公司；B 型尿钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）和β-肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain，β-MHC）引物由上海基康生物技术有限公司合成。

1.2 糖尿病小鼠的建立

雄性C57BL/6 小鼠禁食12 h，腹腔注射55 mg/kg 1% STZ 柠檬酸盐缓冲溶液，正常对照组小鼠注射相同体积的柠檬酸盐缓冲液。连续注射5 d，每次注射后恢复自由取食。STZ 注射7 d后，测空腹血糖，空腹血糖为13.5～25 mmol/L，视为造模成功。

1.3 实验分组及干预

24 只实验C57BL/6 小鼠饲养于联勤保障部队第940 医院实验动物中心，鼠龄4～5 w，分为Ctrl 组（正常对照组）、DM 组（糖尿病组）、DM+ICA 组（糖尿病C57 小鼠灌胃Icariin 溶液80 mg·kg-1·d-1，连续3周）［5］，每组8 只。本实验符合动物伦理规定，伦理审批编号：2020KYLL026。

1.4 实时定量PCR 检测

心肌肥大的标志因子BNP、β-MHC 表达量用实时定量聚合酶链式反应（PCR）检测。具体操作如下：提取各组心肌细胞总核糖核酸（RNA）并反转录为互补DNA（cDNA）。根据文献［6］设计引物序列 ，BNP 正 向 引 物 5′-CAGAAGCTGCTGGAGCTGATAAG-3′； 反 向 引 物 5′-TGTAGGGCCTTGGTCCTTTG-3′；β-MHC 正向引物5′-ATCAAGGGAAAGCAGGAAGC-3′，反 向引物5′-CCTTGTCTACAGGTGCATCA-3′。后委托公司进行引物合成。PCR 反应体系（20 μL）：包括2×SYBR green mix 10 μL，上下游引物各2 μL，10 ng cDNA，加ddH2O2至20 μL。反应条件：95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃60 s，共35 个循环。

1.5 免疫印迹法（western blot）检测蛋白表达

AMPK、mTOR 信号通路及自噬相关蛋白LC3B 及Beclin1，用免疫印迹法检测。根据检测蛋白分子量配制不同浓度的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，将已定量的心肌组织蛋白加入梳孔中，进行电泳。待溴酚蓝到达凝胶远端，应用BIORAD 转膜装置转膜。5%牛血清白蛋白封闭2 h，4 ℃一抗孵育过夜。次日孵育荧光标记的二抗1 h，化学法发光、拍照。

1.6 超声心动图检测

提前1 d 心脏部位脱毛，用三溴乙醇麻醉小鼠，保证小鼠心率500～700 次/min，仰卧位固定采用Vevo 高分辨率动物超声仪对小鼠左室舒张末内径（LVEDD）、舒张期左室后壁厚度（LVPWD）、舒张期左室前壁厚度（LVAWD）、左室舒张末期容积（LVEDV）、左室收缩末期容积（LVESV）等指标进行检测；每组数据均选取连续3 个心动周期测量值的平均值。按照文献报道的方法［7］，计算左室质量EF%=100×［LVEDV-LVESV］/LVEDV。

1.7 统计学处理

采用SPSS19.0 软件进行统计学分析，各组间实验数据以均数±标准误（±SEM）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间均数的比较采用配对t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Icariin 减低糖尿病小鼠心肌BNP 和β-MHC mRNA 表达

DM 组小鼠心肌肥大标志因子BNP mRNA 表达量为（1.65±0.11），显著高于Ctrl 组（1.00±0.05）（t=5.379，P＜0.05）。而Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌BNP mRNA 表达量为（1.20±0.06），显著低于DM 组（t=3.591，P＜0.05）。见图1A。

DM 组小鼠心肌肥大标志因子β-MHC mRNA表达量为（1.40±0.09），显著高于Ctrl 组（1.00±0.05）（t=3.885，P＜0.05）。而Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌β-MHC mRNA 表达量为（1.08±0.06），显著低于DM 组（t=2.958，P＜0.05）。见图1B。

图1 实时定量PCR 检测各组实验动物心肌BNP 和β-MHC mRNA 表达Fig 1 Myocardial hypertrophy markers BNP and β-MHC levels in experimental mice detected by real-time quantitative PCR

2.2 Icariin 减轻糖尿病小鼠左室质量

DM 组小鼠左室质量为(95.28±7.15) mg，显著高 于Ctrl 组(75.29±5.38) mg(t=2.234，P＜0.05）。而Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌左室质量为(74.76±5.52) mg，显著低于DM 组（t=2.272，P＜0.05），见图2A。

3 组试验小鼠心脏射血分数分别为（61.18±5.75）%、（66.73±7.65）%、（64.58±6.20）%，3 组比较，差异无统计学差异（F=0.1807，P＞0.05）。见图2B。

图2 超声心动图检测各组实验动物左室质量和射血分数Fig 2 Left ventricular mass and ejection fraction in experimental mice detected by echocardiogram

2.3 Icariin 抑制糖尿病心肌的自噬

采用免疫印迹法检测各组实验动物LC3B 和Beclin1 蛋白表达，见图3A。结果显示DM 组小鼠心肌自噬相关蛋白Beclin-1 相对表达量为（145.27±8.53），显著高于Ctrl 组（100.0±5.25）（t=4.520，P＜0.05）。而Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌Beclin-1 相对表达量为（115.19±7.94），显著低于DM 组（t=2.581，P＜0.05）。见图3B。

DM 组小鼠自噬相关蛋白LC3B 相对表达量为（128.86±8.31），显著高于Ctrl 组（100.0±5.56）（t=2.886，P＜0.05）。而Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌LC3B 相对表达量为（98.45±5.61），显著低于DM组（t=3.033，P＜0.05）。见图3C。

图3 免疫印迹法检测各组小鼠心肌LC3B 和Beclin-1 蛋白表达Fig 3 Myocardial LC3B and Beclin-1 protein expression in experimental mice detected by Western blotting detection

2.4 Icariin 通过AMPK-mTOR 信号通路抑制糖尿病心肌自噬

免疫印迹法检测各组实验动物心肌AMPK、p-AMPK、mTOR 及p-mTOR 蛋 白 表 达，结 果 见 图4A。 DM 组小鼠心肌p-AMPK 相对表达量为（160.37±8.77），显著高于Ctrl 组（100.0±5.26）（t=5.903，P＜0.05）。而Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌p-AMPK 相对表达量为（108.45±7.19），显著低于DM 组（t=4.578，P＜0.05）。见图4B。

DM 组小鼠心肌p-mTOR 相对表达量为（68.22±7.67），显著低于Ctrl 组（100.0±4.98）（t=3.475，P＜0.05）。而Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌pmTOR 相对表达量为（93.40±7.46），显著高于DM 组（t=2.353，P＜0.05）。见图4C。

图4 免疫印迹法检测各组实验动物心肌AMPK、p-AMPK、mTOR 及p-mTOR 蛋白表达Fig 4 Myocardial AMPK，p-AMPK，mTOR and p-mTOR protein expression in experimental animals detected with Western blotting method

2.5 mTOR 抑制剂Rapamycin 抵消Icariin 改善心肌肥厚的作用

DM 组小鼠左室质量为（95.78±6.23）mg，显著高于Ctrl 组（78.49±4.41）mg（t=2.265，P＜0.05）；Icariin 灌胃糖尿病小鼠心肌左室质量为（77.58±5.14）mg，显著低于DM 组（t=2.253，P＜0.05）。然而，DM+ICA+R 组 心 肌 左 室 质 量 为（98.27±6.54），表明mTOR 抑制剂Rapamycin 可抵消Icariin改 善 心 肌 肥 厚 的 作 用（t=2.487，P＜0.05）。见图5。

图5 超声心动图检测各组实验动物左室质量Fig 5 Left ventricular mass in experimental animals detected by echocardiogram

3 讨论

糖尿病心肌病是心衰的重要原因，而心脏肥厚和舒张功能障碍是糖尿病心肌病的主要标志［8］。同以往的研究结果相似，本研究建立了糖尿病小鼠动物模型，通过实时定量PCR 及心脏超声检测发现糖尿病小鼠心肌BNP及β-MHC基因表达显著升高，左室质量增加。BNP 及β-MHC 是心肌肥厚的分子标志，检测这些基因的表达改变不仅可以确认心脏肥厚的存在，而且可以判断肥厚的程度以及预后［9］。

细胞代谢，增殖，非编码RNA，免疫应答，翻译调节和表观遗传修饰正向或负向调节心脏肥大［10］。而最新研究表明，细胞自噬在心肌肥大中发挥重要的作用［11］，缬沙坦降低高血压动物模型的心脏自噬及 左 室 肥 厚［12］。大 蒜 素 通 过PI3K/Akt/mTOR 和MAPK/ERK/mTOR 信号通路抑制自噬，减轻心肌肥大［13］。本研究发现糖尿病心肌LC3 和Beclin1 蛋白表达显著升高，LC3 与Beclin-1 蛋白参与细胞自噬体的形成，可以反映糖尿病心肌细胞的自噬功能的增强。自噬作为机体的一种自我防御机制，保护心肌细胞减轻衰老及缺血诱导的心肌肥大；然而，过度激活的自噬会加重心肌肥厚和纤维化，导致心室扩张，降低收缩功能［14］。

Icariin 是我国常用中草药淫羊藿的活性成分［15］，具有很高的药用价值。多项研究发现，Icariin可通过激活ERK 信号通路，抑制心肌细胞的氧化应激［16］；Icariin 降低糖尿病大鼠心肌胶原含量及心肌线粒体ROS 水平，增加SOD 活性，改善心脏功能［17］。本课题组前期研究也发现：Icariin 能够通过SIRT1/FoxO1 信号通路减轻心脏缺血再灌注损伤［18］。然而，目前尚未见到Icariin 通过调节自噬减轻糖尿病心肌肥大的相关报道。本研究发现Icariin可显著降低糖尿病心肌LC3 和Beclin-1 蛋白表达，表明Icariin 能够改善糖尿病心肌过度激活的自噬功能。

然而Icariin 是如何调控糖尿病心肌的自噬功能目前尚不清楚。细胞的自噬功能受到细胞内多种信号通路的调节［19，20］。通过免疫印迹法和实时定量PCR 检测发现，糖尿病心肌p-AMPK 蛋白的表达显著升高，p-mTOR 表达显著降低，而Icariin 能够逆转上述改变，并且能够降低糖尿病心肌BNP及β-MHC基因的表达；然而，Icariin 逆转左室肥厚的功效可被mTOR 抑制剂Rapamycin 所抵消。上述研究表明Icariin 可能通过增强AMPK-mTOR 信号通路的活性，抑制糖尿病心肌细胞的自噬，减轻心肌肥厚。

综上所述，笔者认为糖尿病心肌自噬功能增强是糖尿病心肌肥厚的重要机制，而Icariin 可能通过AMPK-mTOR 信号通路抑制糖尿病心肌细胞的自噬，减轻糖尿病所致的心肌肥厚。不足的是，本研究未能对糖尿病心肌细胞自噬升高的程度进行量化研究，且调节糖尿病心肌细胞自噬减轻心肌肥厚的具体机制，仍有待进一步的深入研究。

作者贡献度说明：

吴冰：课题设计，文章撰写；张莲：各项试验的完成；郭烽：课题设计与试验完成。