超高效液相色谱-串联质谱法测定虾肉中52种兽药残留

吴益春 ，陈璐，郭海波*，罗海军，王晓煜，周勇

1.舟山市食品药品检验检测研究院（舟山 316013）；2.宁波大学食品与药学学院（宁波 315800）；3.浙江海洋大学食品与药学学院（舟山 316022）

近年来，随着人们对水产品需求的不断扩大，为增加养殖产量、提高经济效益，各类兽药被广泛应用于水产养殖生产。由于兽药在使用过程中存在滥用、误用及不遵守休药期等现象，水产品中存在药物残留的现象较为普遍。这些有兽药残留的水产品，经食用后在人体中蓄积，可能会产生致畸、致癌的严重危害。测定兽药残留及其代谢物的检测方法有气相色谱-质谱法[1-2]、高效液相色谱法[3]、高效液相-串联质谱法[4-8]、超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法[9-10]、三重四极杆复合线性离子阱质谱法[11-12]、超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法[13-14]等，由于不同兽药的理化性质存在较大差异，且同一种兽药还有同系物、异构体、降解产物及共轭物的存在，兽药残留检测主要以分类检测为主[9]，尚无分析方法可以同时涵盖所有的药物种类。试验针对虾肉中的大环内酯类、酰胺醇类、硝基咪唑类、磺胺类、四环素类、喹诺酮类等6个大类52种兽药残留，开发QuEChERS EMR-Lipid结合超高效液相色谱-串联质谱法，为大批量虾类兽药残留的筛查分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜淡水虾、海水虾（各40批，随机采集于浙江舟山市菜市场、农贸市场、超市）；乙腈、甲酸（色谱纯，德国Merck公司）；去离子水Sartourius系统纯净水、十八烷基键合硅胶（C18）、N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）、0.22 μm有机针式滤膜、增强去脂萃取盐包（m无水MgSO4∶mNaCl=4∶1）、增强型去脂分散净化管（EMR-Lipid dSPE管，1 g，15 mL）：上海安谱科技股份有限公司；红霉素等52种兽药（纯度均≥90.0%，标准品，德国Dr.Ehrenstorfer公司）。

1290-6470超高效液相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）；5804R冷冻离心机（德国艾本德公司）；MS-3涡旋振荡器（德国IKA公司）；UV-R超纯水机（法国Millipore公司）；MS205DU电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-6000DV数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；N-EVAPTM111氮吹仪（美国Organomation公司）。

1.2 色谱-质谱条件

液相色谱柱ZORBAX Eclipse plus C18柱（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；柱温30 ℃；进样量5 μL；流动相A为0.2%甲酸水溶液、流动相B为乙腈溶液（含0.2%甲酸）；流速0.5 mL/min。梯度洗脱程序：0～0.5 min，2% B；0.5～1.8 min，2%～15% B；1.8～3.5 min，15%～20% B；3.5～6.0 min，20%～25% B；6.0～7.0 min，25%～30% B；7.0～11.0 min，30%～35% B；11.0～16.0 min，35%～100% B；16.0～26.0 min，100% B。

离子源，电喷雾离子源；扫描方式，正负离子切换扫描；检测方式，多反应监测（MRM）模式检测；毛细管电压正离子4500 V，负离子3500 V；干燥气温度350 ℃；干燥气流量5 L/min；雾化气压力45 psi；鞘气温度300 ℃；鞘气流速11 L/min；喷嘴电压500 V，其他质谱条件见表1。

表1 代表性化合物质谱参数

1.3 标准溶液的配制

准确称取适量标准品，置于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈分别溶解并定容至刻度，配制成100 mg/L的标准储备溶液，在-18 ℃下避光保存备用。混合标准溶液：分别取上述标准储备溶液，用乙腈配制成1 mg/L的混合标准溶液，在2～4 ℃冰箱保存。

配制基质匹配混合标准溶液。取若干空白试样，按1.4的方法处理与净化，用该空白试样溶液和混合标准溶液配制成质量浓度2～500 ng/mL基质匹配的混合标准系列溶液。该系列溶液临用现配。

1.4 样品前处理

准确称取2.0 g（精确至0.01 g）均质后的试样置于50 mL聚丙烯离心管中，加入2 mL超纯水，加盖旋涡混匀1 min后，加入8 mL 1%甲酸乙腈，加入增强去脂萃取盐包，涡漩混匀1 min，超声提取30 min，按6000 r/min离心5 min，取上清液，待净化。取2 mL上清液移入QuEChERS EMR-Lipid dSPE管中，涡漩混匀1 min，静置5 min，按6000 r/min离心5 min后，将上清液移入15 mL离心管中，于50 ℃水浴氮气吹干，加入1 mL 20%乙腈溶液复溶，旋涡混匀30 s，经0.22 μm滤膜过滤后，供UPLC-MS/MS测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

优化碎裂电压、碰撞能量等仪器条件设置，筛选高响应特异离子对等质谱条件，采用正负离子扫描多反应监测模式，一针进样完成所有目标物的检测。各代表性化合物质谱参数见表1，6种代表化合物的MRM色谱图见图1。

图1 每类兽药代表性化合物在多反应监测模式下的色谱图

2.2 样品前处理条件优化

2.2.1 提取条件优化

选择南美白对虾为试验对象，通过添加回收试验，考察甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮4种试剂的提取效率。试验结果表明，乙酸乙酯和丙酮对虾肉中的杂质萃取较多，影响兽药残留回收率，平均回收率均低于50%。选取甲醇和乙腈2种有机溶剂进行考察，结果显示乙腈对多数目标物均有较好的溶解性和较高的提取率[15-16]，各种兽药平均回收率为89.4%，优于甲醇。因此，试验选择乙腈作为提取溶剂。

2.2.2 净化条件优化

由于虾肉中干扰物主要是脂肪、蛋白质、色素等，为有效去除干扰物质，考察常用净化材料C18、PSA、增强型去脂分散净化管对于待测目标物含量的影响。结果表明，PSA对样品中一些强极性杂质、脂肪酸、色素等具有良好的净化效果，但PSA吸附磺胺类药物，磺胺类药物回收率最低，仅34.0%，C18粉对样品中蛋白质和脂类物质有一定吸附效果[17]，但净化效果不够理想，个别样品存在净化后溶液较为浑浊现象。增强型去脂分散净化材料能减少脂质基质对兽药的吸附干扰，各种兽药残留最低回收率能够达到60%以上，而且净化后的液体不存在浑浊现象。因此，最终选择增强型去脂分散净化管作为净化剂。

2.3 线性范围、检出限与定量限

采用基质匹配标准曲线进行定量，以抵消基质效应的影响，以目标物的峰面积为纵坐标（y），以相应的质量浓度质量（μg/L）为横坐标（x）绘制标准曲线。试验结果表明，各目标物线性关系良好，相关系数均大于0.99，线性范围较宽。以3倍信噪比（S/N）计算检出限，各种兽药检出为0.36～14.00 μg/kg，结果见表2。

表2 52种兽药的线性范围、线性方程、相关系数、检出限、定量限、加标回收率和精密度

2.4 方法回收率与精密度

在空白南美白对虾中分别添加低、中、高3个水平的混合标准溶液，每个添加水平重复测定6次，同时计算相对标准偏差来考察精密度，具体结果见表2。结果表明，3个添加水平下目标化合物的平均回收率为61.2%～119.5%，相对标准偏差为1.0%～13.7%，符合实际检测要求。

3 结论

该试验建立了虾肉中大环内酯类、酰胺醇类、硝基咪唑类、磺胺类、四环素类、喹诺酮类6个大类52种理化性质相差较大目标化合物的分析检测方法。为获得满意的分析物回收率，对仪器条件、提取方式、净化方式进行优化，52种兽药检出限为0.36～14.00 μg/kg，回收率为61.2%～119.5%。该方法简单、快速、准确，适用于对大批量虾类样品中兽药残留的快速筛查，具有较高的实际应用价值。