三种中药活性成分对吗啡依赖斑马鱼脑中dre-miR-723-5p表达的影响

朱 晨，林汝堃，区炳雄，陈志杰，罗超华，莫志贤，李 璟

(1. 南方医科大学中医药学院，2. 广州中医药大学第二附属医院，3. 南方医科大学中心实验室，广东 广州 510515)

吗啡滥用是全球性的公共卫生问题，长期使用吗啡引起的大脑神经化学物质变化与基因表达改变密切相关[1]。越来越多的证据显示，成瘾性物质能诱导 miRNAs表达水平的变化，而成瘾相关脑区中miRNAs表达的改变直接参与了对成瘾行为的调节[2]。青风藤和钩藤是中药戒毒复方的常用药，结合本研究团队前期大量的临床和基础研究[3]，选用青风藤和钩藤的主要生物碱：青藤碱、钩藤碱和异钩藤碱进行抗吗啡依赖机制研究。本研究通过建立吗啡依赖斑马鱼模型，探讨青藤碱、钩藤碱和异钩藤碱抗吗啡依赖的作用机制。

1 材料

1.1 药品与试剂盐酸吗啡(解放军总后勤部药物供应站，批号：710303)；美沙酮(天津中央药业有限公司，批号：020111)；青藤碱(湖南正清制药集团，批号：20000528)；钩藤碱(江西佰草源生物科技有限公司，批号：BCY-0246)；异钩藤碱(江西佰草源生物科技有限公司，批号：BCY-0778)；三卡因甲基磺酸盐(美国Sigma公司，批号：MS222)。

1.2 主要仪器斑马鱼CPP箱(16 cm×9 cm×9 cm)；Noldus Ethovision XT 8.5软件(荷兰Noldus公司)；Agilent 2200 TapeStation(美国Agilent Technologies公司)；ND-1000 Nanodrop(美国Thermo Fisher公司)；Qubit 2.0(美国Life Technologies公司)；Hiseq 2500(美国Illumina公司)；梯度PCR仪(美国ABI公司)；实时定量PCR(美国Roche公司)。

1.3 实验动物斑马鱼(野生型，雌雄各半，体质量约0.35g，6-10个月)由南方医科大学中医药学院人类疾病斑马鱼模型与药物筛选实验室提供。养鱼系统为上海海圣斑马鱼养殖系统(水温为28 ℃)；鱼用盐水浓度为0.03%-0.04%；pH值为7.2-7.6；光照条件为14 h光照(8 ∶00 am-10 ∶00 pm)，10 h黑夜(10 ∶00 pm-8 ∶00 am)。

2 方法

2.1 条件性位置偏爱(Conditioned place preference，CPP)模型的建立吗啡依赖斑马鱼条件性位置偏爱模型的建立方法参考本课题组前期文献报道[4]。CPP实验共分为3个阶段，共持续9 d。第1阶段(d 1-3)为实验前基线测定，斑马鱼适应性喂养结束后，将斑马鱼放置在CPP箱中，观察并记录其在CPP箱中的运动，剔除对白箱明显偏爱的斑马鱼(≥95%的斑马鱼天性偏爱黑箱)。第2阶段(d 4-8)为正式实验阶段，将符合基线测定的斑马鱼随机分为6组(n=10)，分别为对照组、模型组(40 mg·kg-1)、美沙酮组(40 mg·kg-1)、青藤碱组(80 mg·kg-1)、钩藤碱组(100 mg·kg-1)和异钩藤碱组(100 mg·kg-1)。在d 4、d 6、d 8上午8 ∶00，将斑马鱼麻醉后进行吗啡腹腔注射，随后放入CPP箱中的伴药箱(白箱)中训练45 min；在d 5、d 7同一时间，将斑马鱼麻醉后进行生理盐水腹腔注射，随后放入CPP箱中的偏爱箱(黑箱)中训练45 min；d 4-8下午8 ∶00，除对照组和模型组腹腔注射等体积生理盐水，其余给药组分别给予各自药物。第3阶段(d 9)即末次给予吗啡24 h后进行CPP测定，观察并记录斑马鱼在CPP箱中的停留时间和运动轨迹，用Noldus Ethovision XT 8.5软件进行分析。行为学测定结束后，将斑马鱼冷冻处死，剪下头部，显微镜下取出脑组织，-80 ℃保存。

2.2 小RNA测序根据TRIzol试剂盒说明书进行总RNA提取，利用ND-1000 Nanodrop和Agilent 2200 TapeStation进行浓度和纯度检测；通过质检的样品，以1 μg Total RNA≥50 ng small RNA起始量进行文库构建，主要步骤为：3’adaptor 连接、5’adaptor 连接、第一链cDNA合成、PCR扩增、片段大小选择和文库质检；通过质检的文库，按照 HiSeq 2500 User Guide中所述的方法进行上机样本制备；上机操作如下：使用Single Read Flow Cell，按照HiSeq 2500 User Guide的指示进行HiSeq2500上机操作，并运行single-end(1×50)标准测序程序；测序程序运行完毕，对所得数据进行生物信息学分析。

2.3 qRT-PCR验证dre-miR-723-5p的表达根据TaKaRa PrimeScript RT试剂盒和TaKaRa TB Green®Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行对斑马鱼脑中dre-miR-723-5p含量进行检测。qRT-PCR实验均在LightCycler® 96 real time PCR系统上操作。实验中涉及的基因引物是由广州瑞博生物科技有限公司设计提供，其中dre-miR-723-5p的引物序列为(上游引物: 5′-GACAGUUUUAAAUGAUGUUACUUU-3′；下游引物: 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3′)；18S rRNA (上游引物：5′-TCGCTAGTTGGCATCGTTTATG-3′；下游引物：′-CGGAG GTTCGAAGACGATCA-3′)。

2.4 靶基因预测和生物信息学分析使用三个靶基因数据库(miRanda、PITA和RNAhybrid)对dre-miR-723-5p靶基因进行预测，使用Kobas 3.0对预测的靶基因进行GO和KEGG通路分析。

3 结果

3.1 青藤碱、钩藤碱和异钩藤碱可以有效抑制吗啡依赖引起的斑马鱼行为学变化如Fig 1所示，与对照组相比，模型组斑马鱼在伴药箱中的停留时间和运动轨迹明显增加(P<0.01)，提示吗啡依赖斑马鱼CPP模型成功建立；与模型组相比，美沙酮组、青藤碱组、钩藤碱和异钩藤碱组斑马鱼在伴药箱中的停留时间和运动轨迹明显减少(P<0.01)，表明给予药物处理可明显抑制吗啡依赖引起的斑马鱼CPP效应，而上述各给药组间差异无显著性。

Fig 1 Effects of sinomenine, isorhynchophylline, and rhynchophylline on time spent in drug-pair box and movement track in zebrafish n=10)

3.2 青藤碱、钩藤碱和异钩藤碱可以改善吗啡依赖引起的斑马鱼脑中miRNAs的表达变化如Fig 2所示，与对照组相比，模型组中有17个miRNAs的表达明显下调，37个miRNAs的表达明显上调(Fig 2A)；与模型组相比，美沙酮组中有9个miRNAs的表达明显下调，10个miRNAs的表达明显上调(Fig 2B)；与模型组相比，青藤碱组中有4个miRNAs的表达明显下调，8个miRNAs的表达明显上调(Fig 2C)；与模型组相比，钩藤碱组中有6个miRNAs的表达明显下调，8个miRNAs的表达明显上调(Fig 2D)；与模型组相比，异钩藤碱组中有21个miRNAs的表达明显下调，14个miRNAs的表达明显上调(Fig 2E)。在上述miRNAs中，有5个miRNAs(dre-miR-124-3p, dre-miR-723-5p, dre-miR-1306, dre-miR-2189, 和dre-miR-735-5p)在各组中均存在差异表达(Fig 2F，Tab 1)。

Fig 2 Expression profiles of miRNAs between six groups

Tab 1 Differentially expressed miRNAs in zebrafish brain

3.3 qRT-PCR验证dre-miR-723-5p的表达为了验证小RNA测序的结果，本研究选择差异表达量最大的dre-miR-723-5p进行qRT-PCR验证。如Fig 3所示，qRT-PCR结果与小RNA测序结果一致(对照组：2-ΔΔct=1；模型组：2-ΔΔct=8.63；美沙酮组：2-ΔΔct=2.53；青藤碱组：2-ΔΔct=2.34；钩藤碱组：2-ΔΔct=2.72；异钩藤碱组：2-ΔΔct=2.22)(Fig 3)。

Fig 3 Expression of dre-miR-723-5p confirmed by

3.4 dre-miR-723-5p靶基因预测及靶基因GO和KEGG通路分析如Fig 4所示，3个数据库共同预测dre-miR-723-5p的靶基因为99个(Fig 4A)；GO分析结果显示，这些靶基因主要富集在生物过程、细胞组成和分子功能三个方面；KEGG通路分析结果显示，这些基因可能与MAPK信号通路、溶酶体、细胞因子受体相互作用和细胞凋亡有关(Fig 4C)。

Fig 4 GO and KEGG pathway analysis of putative dre-miR-723-5p target genes

4 讨论

吗啡的镇静镇痛效果极佳，是临床上治疗疼痛的一线药物，但其长期使用易导致依赖。CPP常被用于药物心理依赖性潜力和特征研究。研究表明，将CPP试验在人体上，受试人与受试动物一样，给予成瘾物质后，均表现出对伴药侧的偏爱，提示机体对药物的主观反应与机体产生位置偏爱关系密切[5]。在本研究中，与对照组相比，斑马鱼腹腔注射吗啡(40 mg·kg-1)后，经过CPP训练，其在伴药箱(白箱)中的停留时间和运动轨迹明显增加，表明吗啡依赖斑马鱼CPP模型成功建立。与模型组相比，青藤碱组、钩藤碱组和异钩藤碱组斑马鱼在伴药箱中的停留时间和运动轨迹明显减少，表明青藤碱、钩藤碱和异钩藤碱可抑制吗啡引起的斑马鱼CPP效应。

清风胶囊主要用于控制海洛因成瘾者的早期戒断症状，青藤碱是清风胶囊的主要活性成分。本团队前期研究发现，青藤碱可以通过调节小鼠大脑中TH、NR2B和MOR的表达来逆转吗啡诱导的奖赏作用[6]，还可以通过NMDAR1/CAMKII/CREB通路在体内和体外发挥对吗啡依赖性的保护作用[7]。现代药理研究表明，大叶钩藤对中枢神经系统具有镇静、抗癫痫、抗惊厥和神经保护作用。本团队前期研究表明，钩藤碱可以抑制甲基苯丙胺诱导的小鼠和斑马鱼的CPP行为，并抑制脑中TH蛋白的表达[8]。钩藤碱可抑制苯丙胺依赖大鼠的CPP效应，并降低伏隔核和杏仁核中NR2B蛋白和NR2B mRNA的表达。此外，钩藤碱还可以抑制METH诱导的大鼠伏核中GluR2/3亚基蛋白的上调和下丘脑中GluR2/3亚基蛋白的表达下调[9]。

近年来研究表明，miRNA在中枢神经系统中高表达，其中包括脑和脊髓这些阿片类药物的高度活跃区域[10]。miRNA对于基因表达调控的十分重要，它们参与了机体多数生理过程，例如药物成瘾、疼痛感、神经元发育、病毒感染和阿片样物质受体调控等。研究发现，慢性吗啡处理后，人胚胎肾293/μ细胞中的miR-139-5p表达上调[11]；小鼠背根神经节中miR-375的表达水平明显下调，且miR-375的表达水平上调与吗啡耐受相关[12]，表明miRNA参与了阿片类物质的成瘾。

本研究通过小RNA测序对斑马鱼脑中miRNA表达谱进行检测。结果发现，与对照组相比，模型组中的54个miRNAs发生了明显变化。与模型组斑马鱼相比，美沙酮组中的19个miRNAs，青藤碱组中的12个miRNAs，钩藤组中的14个miRNAs和异钩藤碱组中的35个miRNAs的表达具有明显差异。经过韦恩分析发现，有5个miRNAs是在各组中均表现出差异表达的，其中两个在模型组中的表达明显上调(dre-miR-124-3p、dre-miR-723-5p)，在经过药物美沙酮、青藤碱、钩藤碱和异钩藤碱治疗后明显下调；三个在模型组中的表达明显下调(dre-miR-1306、dre-miR-2189、dre-miR-735-5p)，经过药物治疗后均明显上调。dre-miR-723-5p是其中差异表达量最大的miRNA。基于此，本研究通过qRT-PCR验证其在斑马鱼脑中的表达，该结果与测序结果相吻合。目前，关于dre-miR-723-5p的研究很少，本实验发现并验证dre-miR-723-5p在吗啡依赖斑马鱼脑中的差异表达，为吗啡依赖研究提供了新的方向。

为了进一步了解dre-miR-723-5p的生物学功能，本研究通过靶基因预测数据库(PITA、miRDB、RNAhybrid)对dre-miR-723-5p进行靶基因的预测，结果发现了99个潜在靶基因，包括生物过程、细胞组成及分子功能三个部分，涵盖了调节对外部刺激的反应、正面调节轴突再生、囊泡与高尔基体融合和高尔基空泡运输等方面。通过KEGG通路分析发现，这些基因主要涉及了MAPK信号通路、溶酶体、细胞因子受体相互作用和细胞凋亡。研究证实，MAPK信号通路介导神经可塑性的变化，并参与外周和中枢的疼痛调节。对促进神经元进程和大脑保护具有显着的积极调节作用[13]。溶酶体途径是神经元存活许多方面的常见纽带之一，其功能障碍主要与中枢神经系统的衰老有关。溶酶体形态和功能障碍被认为是阿尔茨海默病的最早病理改变[14]。在海洛因成瘾大鼠的大脑中广泛存在神经元和星形胶质细胞凋亡的现象[15]，且长期使用吗啡可导致大鼠海马细胞凋亡程度的异常增加[14]。KEGG通路分析结果表明，dre-miR-723-5p靶基因与脑部疾病和药物成瘾密切有关。

综上，吗啡依赖斑马鱼脑中miRNA表达谱及中药活性成分青藤碱、钩藤碱和异钩藤碱的作用，并对相关miRNA进行验证、靶基因预测、GO分析和KEGG通路分析。在miRNA水平上揭示了青藤碱、钩藤碱和异钩藤碱抗吗啡依赖的分子机制，这可能为中药抗阿片类药物依赖研究提供新思路。