miR-5088-5p在同型半胱氨酸致肝细胞焦亡中的保护作用研究

董小艳,刘达越,徐灵博,顾铃毓,姜怡邓,杨安宁,焦 运,李桂忠

(宁夏医科大学 1.基础医学院、2.国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室、3.宁夏血管损伤与修复研究重点实验室、4.临床医学院、5.总医院感染科，宁夏回族自治区，宁夏 银川 750004)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)来源于蛋氨酸，其主要在肝脏中代谢，蛋氨酸代谢失调引起血浆中同型半胱氨酸积聚形成高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)[1]。研究表明，在肝脏脂肪变性患者血液样本中血浆Hcy水平明显升高，说明HHcy是肝脏疾病的重要危险因素[2]。同时，有学者认为高迁移率族蛋白1通过组织蛋白酶V依赖途径介导同型半胱氨酸诱导内皮细胞焦亡[3]。还有研究显示，在非酒精性脂肪肝、肝纤维化、肝硬化、肝癌等疾病中肝细胞焦亡水平明显升高[4]，过多的细胞焦亡会导致细胞无菌性炎症，加速肝损伤。可见细胞焦亡与肝脏疾病的进展密切相关，但在许多方面仍尚不清楚。miRNAs是一种18-24个核苷酸的非编码RNA，可通过调控细胞焦亡参与肝脏代谢失调、肝损伤、肝纤维化和肿瘤等多种疾病的发生发展，这使miRNAs的调控成为诊断和治疗肝病的一个切入点[5]。故本研究目的是探讨miR-5088-5p在Hcy致肝细胞焦亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂CO2细胞培养箱(Thermo Fisher，美国Scientific公司)；BS110S型精密天平(Sar-toriu公司)；5415D型微量台式离心机(Eppendorf公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；普通PCR仪与qRT-PCR仪(耶拿公司)；细胞全蛋白提取试剂盒(P0013F，上海贝博生物技术有限公司)；胎牛血清和RPMI 1640培养液(2021472，812006，Gibco公司)；逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒(AJ90851A，AJE1566A，宝日医生物技术(北京)有限公司)；总RNA提取试剂盒(U9223，北京天根生物科技有限公司)；CBS+/-和CBS+/+美国Jackson实验室(Bar Harbor，ME)提供；脂质体LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)；Hcy(STBJ0903，优级纯，德国Sigma公司)、miR-5088-5p上下游引物(S0626，Q1229，广州锐博生物科技有限公司)； NLRP3(#10151，美国Cell Signaling Technology公司)；Caspase 1(AF5418，中国Affinity公司)；IL-1β(AF5103，购自中国Affinity公司)；内参抗体β-actin(AC028，中国abclonal公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与分组 人源肝细胞株(HL-7702)购自上海名劲生物科技有限公司，在37 ℃、5% CO2环境中培养，次日用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基换液，当细胞密度增长到70%-80%时用0、100 μmol·L-1Hcy干预，分为Control组、Hcy(100 μmol·L-1)组[1]、100 μmol·L-1Hcy+miR-5088-5p NC组和100 μmol·L-1Hcy+miR-5088-5p mimic组，培养48 h后收集细胞用于后续实验。

1.2.2动物分组及饲养 4周龄体质量约20 g的CBS小鼠购自美国Jackson实验室，在宁夏医科大学实验动物中心饲养，随机选取12只雄性基因正常小鼠(CBS+/+，n=6)和单基因敲除(CBS+/-，n=6)小鼠给予高蛋氨酸(2%高蛋氨酸)饮食，饲养在SPF级环境中，温度(22-25) ℃，湿度55%-65%，给饲养房环境定期紫外消毒，小鼠喂养12周之后处理用于后续实验。

1.2.3Western blot测定焦亡相关蛋白的表达 将各组肝细胞裂解提取总蛋白，采用BCA试剂盒进行定量后，加入蛋白上样缓冲液95 ℃煮沸5 min变性，经SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭，4 ℃孵育兔抗鼠NLRP3抗体(1 ∶500)、兔抗鼠caspase 1抗体(1 ∶500)、兔抗鼠 IL-1β抗体(1 ∶500)过夜；PBST洗膜3次，每次8 min，加HRP标记的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)，室温孵育2 h时；PBST洗膜3次，每次8 min，配制ECL试剂化学发光液，显影，β-actin作为内参，计算NLRP3、Caspase 1与IL-1β灰度值用来分析。

1.2.4qRT- PCR检测肝细胞中miR-5088-5p的表达 委托锐博生物科技有限公司设计合成miR-5088-5p的引物。根据RNA提取试剂盒提取肝细胞总RNA，逆转录成cDNA，逆转录反应条件为：42 ℃ 15 min，37 ℃ 5 s，4 ℃保存。荧光定量PCR扩增程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5s，60 ℃ 34s，45个循环，反应结束后，根据扩增曲线数据，按照公式2-△△Ct计算miR-5088-5p的含量，ΔΔCt=(Ct待测样本目的基因-Ct待测样本内参基因)-( Ct校正样本目的基因-Ct校正样本内参基因)。

1.2.5转染miR-5088-5p至肝细胞 转染方法：培养肝细胞至对数生长期，待细胞融合达到80%，在1.5 mL EP管中加入10 μL mimic/10 μL NC融到490 μL纯RPMI 1640培养基中，混匀，10 μL Lipofectamine 2000融到490 μL纯RPMI 1640培养基中轻轻吹匀，静止5 min，再将混合转染试剂和mimic稀释液混合轻轻吹吸5次，室温下静止20 min，将上述转染混合物加入培养瓶再加纯RPMI 1640培养基补齐至4 mL，放入培养箱继续培养，6 h后换液用Hcy刺激48 h，严格根据说明书将miR-5088-5p模拟物和miR-5088-5p阴性对照转染到HL-7702细胞用于后续实验。

1.2.6鉴定小鼠基因型 取小鼠脚趾，根据基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。选用巢式降落式特异性PCR反应扩增DNA，扩增程序如下：95 ℃ 2 min 1×;95 ℃ 20 s 65 ℃ 15 s 68 ℃ 10 s, 10×;95 ℃ 15 s 60 ℃ 15 s 72 ℃ 10 s, 28×;72 ℃ 2 min, 1×;10 ℃保存，反应结束后，配制2%琼脂糖凝胶，140 V电泳20 min，显影仪曝光，保存结果。

1.2.7检测小鼠血清同型半胱氨酸水平 将小鼠麻醉后，称体质量，固定，眼球取血并5 000 r·min-1离心，收集上清，采用全自动生化仪检测其血清中同型半胱氨酸的水平。

1.2.8采用免疫荧光染色检测肝组织焦亡相关蛋白表达 将石蜡切片在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各脱蜡20 min，100%、95%、85%、75%、50%梯度酒精水化，抗原修复，自然冷却至20 ℃，3%过氧化氢封闭之后，0.3% Triton X-100 室温通透8 min，5%山羊血清封闭2 h，4 ℃环境下孵育一抗NLRP3(1 ∶50)、caspase 1(1 ∶150)和IL-1β(1 ∶200)过夜，PBS溶液清洗切片3次，每次6 min，滴加Cy3标记的荧光二抗室温下孵育2.5 h，洗片后滴加DAPI，封片荧光显微镜下观察并采集图像。

2 结果

2.1 肝细胞中NLRP3、Caspase 1和IL-1β 蛋白表达情况为了探讨Hcy对肝细胞焦亡的影响，通过Western blot检测焦亡相关蛋白，与Control组相比，Hcy组NLRP3、caspase 1和IL-1β蛋白表达水平明显升高(均P<0.01)，表明Hcy能够促进肝细胞焦亡，见Fig 1。

Fig 1 Expression of NLRP3, Caspase-1 and IL-1β in hepatocytes detected by Western n=3)

2.2 肝细胞中miR-5088-5p表达水平为了验证miR-5088-5p在Hcy致肝细胞焦亡过程中的变化，采用qRT-PCR检测肝细胞中miR-5088-5p表达水平，结果显示：与Control组相比，Hcy组miR-5088-5p的表达水平降低(P<0.01)，提示miR-5088-5p可能参与Hcy诱导的肝细胞焦亡，见Fig 2。

Fig 2 mRNA expression of miR-5088-5p in hepatocytes detected by

2.3 过表达miR-5088-5p后肝细胞焦亡相关蛋白表达情况为进一步研究miR-5088-5p在肝细胞焦亡中的作用，将miR-5088-5p mimic转染至肝细胞，分为Control组，Hcy组，Hcy+NC组，Hcy+mimic组，采用Western blot检测NLRP3、Caspase-1和IL-1β蛋白的表达，结果显示：与Hcy组相比，Hcy+NC组NLRP3、caspase 1和IL-1β蛋白的表达无差异；与Hcy+NC组相比，Hcy+mimic组NLRP3、Caspase 1和IL-1β蛋白的表达明显下降(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，表明miR-5088-5p过表达可以减少由Hcy引起的肝细胞焦亡的增加，见Fig 3。

Fig 3 Expression of NLRP3, caspase 1 and IL-1β Protein in hepatocytes after transfection of miR-5088-5p

2.4 鉴定CBS小鼠基因型及检测小鼠血清Hcy水平为了验证小鼠为基因敲除小鼠，进行CBS小鼠基因型鉴定，结果见Fig 4A，针对小鼠基因型设计特异性引物，采用普通PCR对基因敲除小鼠进行鉴定，其中，单条带为CBS+/+小鼠，双条带为CBS+/-小鼠。同时采用全自动生化仪对小鼠血清同型半胱氨酸水平进行检测，结果显示，与CBS+/+组小鼠比较，CBS+/-组小鼠血清中Hcy浓度升高(P<0.01)，表明CBS小鼠模型复制成功，见Fig 4B。

2.5 免疫荧光检测肝组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达水平为了明确Hcy引起焦亡相关蛋白的表达增加，采用免疫荧光检测肝组织中NLRP3、caspase 1、IL-1β蛋白表达(见Fig 5A、C、E)并对小鼠肝脏组织中NLRP3、caspase 1、IL-1β蛋白的阳性面积进行定量分析，其中红色代表NLRP3、caspase 1、IL-1β表达含量，蓝色代表细胞核。结果显示：与CBS+/+小鼠相比，CBS+/-组小鼠肝组织中NLRP3、caspase 1、IL-1β蛋白的阳性面积比例增加(P<0.01)，表明Hcy能够促进焦亡相关蛋白在肝脏中表达，见Fig 5B、D、F。

3 讨论

Hcy是一种含硫氨基酸，是蛋氨酸代谢的中间产物。Hcy的代谢途径受复杂的酶系统调控，胱硫醚β合成酶(cystathionine b-synthase，CBS)是反式硫化途径中的第一个酶，CBS催化同型半胱氨酸转化为半胱氨酸，当CBS的活性降低，Hcy不能够充分的通过转硫途径转换为胱硫醚，从而在体内蓄积引起肝脏损伤[6-7]，同时升高的Hcy可促进肝细胞凋亡、肝脏纤维化等多种肝脏病变[8-9]。肝脏损伤又进一步导致Hcy的积累进而恶性循环。可见，Hcy与肝脏疾病关系密切。本课题组前期研究发现Hcy可通过下调囊性纤维化跨膜电导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)的表达，导致内质网应激和肝细胞凋亡，CFTR的表达下调在体内外可促进自噬，加重肝损伤[10-11]。为了更进一步探讨Hcy对肝损伤的影响，本实验建立CBS+/-小鼠高同型半胱氨酸血症模型后，肝脏组织免疫荧光结果显示，肝细胞焦亡水平明显增加。说明Hcy可以诱导肝细胞焦亡的发生。

细胞焦亡(pyroptosis)是一种独特的程序性细胞死亡形式，其特征是DNA断裂、染色质浓缩、细胞肿胀且有大气泡，以及细胞内容物泄漏[12]。在细胞焦亡经典途径中，炎性小体起着重要作用。炎性小体是先天免疫系统的一个组成部分，而NLRP3是最常见的炎症小体之一。这种炎症小体诱导的细胞焦亡与炎症性疾病有很强的联系，在细胞、小鼠和人体样本的实验表明，一种特殊的细胞死亡形式—焦亡，会导致复杂的炎性颗粒NLRP3炎性小体从肝细胞内释放到细胞外空间后被其他细胞吸收，从而介导炎症和促纤维化的应激信号，这是新发现的一种肝损伤的新机制[13]。随着我们对涉及细胞死亡的分子机制的不断加深理解，我们对急性和慢性肝损伤如坏死、焦亡和自噬等各种细胞死亡模式有了更广泛的认识[14]。我们的结果表明，Hcy刺激肝细胞后，细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase 1和IL-1β蛋白表达显著增加，说明Hcy可以通过NLRP3炎症小体形成来促进细胞焦亡。

miRNAs是一种内源性非编码RNA，在肝脏疾病中发挥关键作用[15]。有学者研究表明，miR-21缺失抑制了小鼠和人类骨髓细胞中NLRP3和caspase 1的表达，促进NLRP3炎性小体激活，介导焦亡过程[16]。miR-5088-5p属于miRNAs，因此本实验重点关注miR-5088-5p的作用，经Hcy刺激肝细胞后miR-5088-5p表达下调，当过表达miR-5088-5p后，肝细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase 1、IL-1β表达下降，同时免疫荧光结果也证实了该现象，说明miR-5088-5p参与了Hcy引起的肝细胞焦亡，且对肝细胞焦亡有保护作用。目前，抑制焦亡的策略主要有两种。一种是通过调控途径抑制NLRP3炎症体，例如，MCC950被称为NLRP3抑制剂，可以有效减轻胆脂性肝损伤和胆管结扎小鼠模型的炎症[17]。另一种策略是抑制NLRP3炎症小体激活后的下游信号通路。本实验发现miR-5088-5p能够抑制Hcy诱导的肝细胞焦亡，但具体机制有待进一步研究，未来研究方向我们会更加关注NLRP3炎症小体激活后的下游信号通路分子的抑制剂来阻断焦亡过程，为肝病的防治提供新的思路。