王不留行黄酮苷对小鼠动脉粥样硬化的作用及机制

马欣雨，徐 非，龚蕾蕾，程蕊棠，缪孙涵，朱雨薇，蔡维维，侯 豹，邱丽颖

(江南大学无锡医学院, 江苏 无锡 214122)

1 前言

动脉粥样硬化是一种常见的心血管疾病，发病率高、致死率高，极易发展成脑卒中、冠心病等心血管病变，严重威胁人类健康，导致其病发的危险因素复杂多样包括性别、年龄、血压等[1-2]。纤维和脂肪的堆积是动脉粥样硬化的主要表现，可使动脉管腔变窄、弹性降低，一旦发展到阻塞动脉管腔，则可导致该动脉供应的组织或器官缺血、坏死，严重影响机体功能。动脉粥样硬化病理机制复杂，但其主要原因之一是血管内皮受损[3-4]。因此，治疗动脉粥样硬化的靶点之一可能是改善内皮功能。实验室多年的研究发现，王不留行黄酮苷(vaccarin)能够改善高糖诱导的内皮细胞凋亡[5]，促进内皮细胞增殖，从而发挥保护内皮的作用[6]。此外，其对心血管重构、肾病以及肾性高血压大鼠的血压具有改善作用[7]。既往的研究结果表明vaccarin在改善心血管功能中的重要作用，因此本研究将进一步探究vaccarin在小鼠动脉粥样硬化模型中的作用及相关分子机制。

2 材料和方法

2.1 主要药品与试剂王不留行黄酮苷(上海士峰科技有限公司)；高脂饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司)； 油红O染料，DCFH-DA探针试剂盒(上海索莱宝科技有限公司)；Masson染色试剂盒，总胆固醇试剂盒，甘油三酯试剂盒，高密度脂蛋白胆固醇试剂盒，低密度脂蛋白胆固醇试剂盒，苏木素伊红染色试剂盒(南京建成生物有限公司)；小鼠MCP-1、IL-6、ICAM-1、VCAM-1 ELISA试剂盒、Caspase-3活性检测试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；兔抗p38 MAPK抗体，兔抗p65-NFkB抗体，兔抗SM22a抗体，兔抗β-actin抗体，羊抗兔IgGH&L (Alexa Fluor@ 488)抗体，鼠抗Bcl-2抗体，兔抗Caspase-3抗体，兔抗Bax抗体(英国Abcam公司)。

2.2 实验动物本实验所用小鼠，购自南京大学模式动物研究所，为雄性6-8周龄的AopE-/-和C57BL/6J小鼠。空白对照组(WT)与王不留行黄酮苷对照组(WT+Vaccarin)选取C57BL/6J小鼠，正常饲料喂养20周；动脉粥样硬化模型组(ApoE-/-+HFD)组与王不留行黄酮苷治疗组(ApoE-/-+HFD+Vaccarin)则选取AopE-/-小鼠联合高脂饲料喂养20周构建小鼠模型。在第16周时ApoE-/-+HFD+Vaccarin组与WT+Vaccarin组每日腹腔注射vaccarin(1 mg·kg-1)，持续4周；另外两组则注射等量生理盐水。所有动物实验是在江南大学实验动物委员会的批准下进行，动物伦理编号：JN.No 20201130t1280301[327]。

2.3 血清脂质含量测定小鼠禁食不禁水12 h后，戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)腹腔注射，麻醉小鼠后眼球取血，2 500 r·min-1离心20 min后吸取上层血清。按一定比例稀释血清后，检测TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。

2.4 油红O染色检测血管脂质沉积小鼠处死后，取血管以及主动脉根部制作冰冻切片后使用冷冻切片机切片，厚度为10 μm。根据试剂盒说明进行油红O染色。

2.5 ELISA法测定血清炎症因子水平取小鼠血清，检测炎症因子IL-6，ICAM-1，MCP-1和VCAM-1的水平，按照ELISA试剂盒说明，将稀释好的样品以及标准品加入酶标板中，并设空白孔进行对照，加入抗体孵育、洗涤后加入显色液进行反应20 min后加入终止液，采用酶标仪检测OD值，绘制标准曲线，计算样品浓度。

3 结果

3.1 王不留行黄酮苷对ApoE-/-小鼠血糖、血压、体质量的影响与WT小鼠相比，ApoE-/-+HFD小鼠血糖、血压以及体质量均明显上升而腹腔注射vaccarin后，升高的血糖、血压、体质量，出现显著降低现象。另外，WT+Vaccarin组与WT小鼠相比没有血糖、血压和体质量的改变(Tab 1)。上述结果表明，腹腔注射vaccarin可以改善动脉粥样硬化模型小鼠血糖、血压以及体质量。

3.2 王不留行黄酮苷改善ApoE-/-小鼠主动脉的粥样硬化斑块及纤维化的形成油红O染色检测结果表明，WT+Vaccarin组小鼠与WT组相比，主动脉及其根部处无斑块形成。ApoE-/-+HFD+Vaccarin组小鼠与ApoE-/-+HFD组小鼠相比，主动脉斑块面积明显减少，而主动脉根部斑块面积无改变(Fig 1 A, B, D)。另外，Masson染色表明，WT +Vaccarin组与WT组小鼠主动脉均无病变，而ApoE-/-+HFD小鼠主动脉斑块纤维化显著增多，而vaccarin则可缓解纤维化程度(Fig 1 C,D)。Western blot结果同样表明，WT+Vaccarin组与WT组的小鼠相比SM22α的表达无明显变化；而ApoE-/-+HFD组表达明显增加，vaccarin治疗后可明显降低SM22α的表达(Fig 1 E, F)。以上表明，vaccarin可降低ApoE-/-+HFD小鼠动脉粥样硬化斑块的纤维化程度。

3.3 王不留行黄酮苷改善ApoE-/-小鼠血脂代谢及主动脉炎症脂代谢障碍是动脉粥样硬化的重要原因，主要表现为血脂胆固醇含量的升高[8]。实验结果表明，与WT组相比，ApoE-/-+HFD组小鼠血清中TG、TC、LDL-C的水平明显升高，HDL-C明显降低。ApoE-/-+HFD+Vaccarin组与ApoE-/-+HFD组小鼠相比，TG、TC、LDL-C的水平明显降低，HDL-C明显升高(Fig 2A)。此外，主动脉内皮炎症作为血管内皮损伤的因素之一，在动脉粥样硬化进展中发挥了重要作用[9]。因此，我们深入探究了vaccarin对ApoE-/-小鼠炎症的影响。小鼠主动脉qRT-PCR结果显示，IL-6，MCP-1，ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平在WT+Vaccarin组小鼠的主动脉内无明显变化。在高脂饲料喂养的ApoE-/-+HFD小鼠体内则明显上升，此基础上，注射vaccarin后，IL-6，MCP-1，ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平可出现明显下降(Fig 2 B)。同样，ELISA 结果显示，vaccarin抑制ApoE-/-+HFD小鼠黏附因子水平的升高(Fig 2 C)。免疫印迹结果显示，ApoE-/-+HFD小鼠胞核NFκB p65可见明显升高。ApoE-/-+HFD+Vaccarin组中，胞核NFκB p65可见明显下降(Fig 2 D, E)。以上表明，vaccarin可改善动脉粥样硬化小鼠的炎症水平。

3.4 王不留行黄酮苷影响ApoE-/-小鼠主动脉内皮细胞的凋亡Caspase-3活性检测显示，与WT小鼠相比，WT+Vaccarin组小鼠caspase-3活性没有改变，ApoE-/-+HFD组小鼠caspase-3活性明显升高而vaccarin干预后明显降低(Fig 3 C)。免疫印迹结果同样表明，与WT相比，WT+Vaccarin组小鼠caspase-3的切割(c-caspasse-3)、Bcl-2及Bax蛋白水平无明显变化。ApoE-/-+HFD组小鼠的c-caspasse-3及Bcl-2的表达水平升高，抑凋亡蛋白Bax的表达水平下降。Vaccarin干预后，则观察到相反的现象(Fig 3 A, B)。上述结果表明，vaccarin可改善ApoE-/-小鼠主动脉血管内皮细胞的凋亡。

Fig 3 Effect of Vaccarin on apoptosis in ApoE-/-+HFDmice fed with high-fat diet n=3)

3.5 王不留行黄酮苷对ApoE-/-小鼠血管内皮损伤减轻的机制ROS、p38 MAPK参与内皮细胞损伤以及巨噬细胞泡沫化过程，是动脉粥样硬化斑块形成进展中的重要机制[10]。为了检测小鼠体内的氧化应激水平，我们利用DCFH-DA探针来标记ROS。结果显示，ApoE-/-+HFD组的ROS水平可见明显升高，而ApoE-/-+HFD+Vaccarin组中，ROS水平则明显下降(Fig 4 A, B)。免疫印迹结果显示，ApoE-/-+HFD组中，p38 MAPK磷酸化水平明显上升，而vaccarin则可逆转p38 MAPK的磷酸化表达(Fig 4 C, D)。上述结果表明，vaccarin抑制了动脉粥样硬化小鼠ROS/p38 MAPK信号通路的活化。

4 讨论

动脉粥样硬化是一种发病机制复杂的慢性血管炎性疾病，血管内皮损伤及功能障碍在其发生发展过程中，发挥着重要作用[11]。血管内皮损伤可由多种刺激引起，如内皮细胞纤维化、内皮细胞炎症及凋亡等[12]。作为一个中药活性单体，vaccarin可降低高血压大鼠的血压、改善心血管重构、抑制高糖刺激的血管内皮功能障碍[7]，这揭示vaccarin在心血管系统中的重要作用。本文主要探讨的是vaccarin对于动脉粥样硬化的影响及其分子机制。动脉粥样硬化受累动脉病变始于内膜，表现为内膜炎症、纤维化以及脂质沉积。动脉粥样硬化斑块纤维化的形成主要由于脂质积聚，黏附因子增加导致平滑肌迁移至脂质沉积部位后发生坏死，引起细胞外基质过度沉积，形成纤维帽，最终可进一步导致动脉血管硬化[13]。我们的结果显示，与ApoE-/-+HFD组小鼠相比，ApoE-/-+HFD+Vaccarin组小鼠动脉粥样硬化斑块的纤维化水平降低，表明vaccarin可以改善动脉硬化斑块纤维化病变。动脉粥样硬化的发生发展与血管内皮炎症及凋亡密切相关[14]。在本次实验中，我们发现与ApoE-/-+HFD组小鼠相比，ApoE-/-+HFD+Vaccarin组小鼠IL-6、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的表达明显降低，同样vaccarin抑制了NFκB p65蛋白的核转移；以及改善了抑凋亡蛋白Bcl-2的下调和促凋亡蛋白Bax, c-caspase-3的上调。以上结果说明，vaccarin或许可以通过改善血管内皮炎症以及凋亡来达到改善动脉粥样硬化病变的效果。活性氧(ROS)在细胞凋亡以及炎症反应过程中发挥着重要作用[15]，与动脉粥样硬化疾病的发病机制密切相关[16]。另外，ROS在多种病理生理信号转导中发挥重要作用，如p38 MAPK、NFκB p65的激活[18]。p38 MAPK也被证明作为内皮细胞炎症及凋亡的关键靶点参与动脉粥样硬化过程[17]。我们此次的实验结果显示，vaccarin可抑制ApoE-/-+HFD组小鼠主动脉ROS的产生以及p38 MAPK蛋白的磷酸化程度。这进一步说明vaccarin通过抑制ROS/p38 MAPK信号通路活化改善动脉粥样硬化。我们的研究成果表明，vaccarin或可作为治疗与动脉血管内皮损伤相关的心血管疾病的潜在药物。