10株高效菌株对人工污水净化能力研究

潘国营 ，林凤莲 ，袁锋 ，罗倩 ，高倩倩 ，李键 ，吴承祯，陈灿 *

1. 福建农林大学林学院，福建 福州 350002；2. 森林生态系统过程与经营福建省高校重点实验室，福建 福州 350002；3. 武夷学院，福建 南平 354300

水污染问题伴随中国城市化进程加速日益突出（Barletta et al.，2019），污水处理法也不断改进。2015年中国废水排放总量为 7.353×1010t，仅城镇生活污水排放量就达到 5.352×1010t（李国令等，2020），严重影响到饮用水安全和水体生态系统的平衡（吉立等，2017）。微生物技术的进步为污水处理提供了广阔的应用前景（文武等，2007；丁健生等，2014；张琼等，2019），它们被广泛应用于石化废水（李静等，2017）、生活废水（伍海全等，2017）、工业废水（叶春松等，2019）处理等方面。现阶段微生物处理污水技术主要有生物膜法（温东辉等，2014）、氧化塘法、吸附法（刘冠军，2018）、固定化微生物技术（张泽钰等，2020）等。相比传统方法，微生物处理技术有持续时间长、无二次污染、经济效益好和环境效应佳等优点，是绿色低能耗污水处理技术（彭轶等，2016；张庆云等，2017）。然而，上述技术或方法仍面临占地面积大、局限于特定的污水水质和污水类型等问题。因此，近年来众学者在微生物基础上积极探索净化污水新方法，其中，根际微生物菌株分离和复合菌剂抽取应用于不同类型污水处理技术已成为热点之一。

微生物菌种的筛选和菌剂的构建拥有污水处理能力的巨大潜力。筛选菌种方面，一些耐冷菌种对低温（黄秋婷等，2020）污水净化效果较好；菌剂的构建方面，投加微生物菌剂的生物强化系统对城市污水中 COD等非金属离子的去除率提高了31.82%—70.56%（张兰河等，2013）。微生物菌剂构建的基础是菌株分离，然而，当前菌株分离多针对特定的污水、环境或单一菌株，且国内微生物菌剂以仿制品或多种功能菌复配为主，多为游离态，稳定性差，针对性弱，投入量大（唐伟等，2019）。污水中植物根际环境多变，细菌和真菌菌株与污水净化之间关系复杂，直接应用在污水处理中存在限制性。湿地植物根系中存在大量有一定去污能力的细菌和真菌（胡智勇等，2010），但去污效率、功能和稳定性差异大，且相关研究较为缺乏（Yong et al.，2015），因此，如何筛选高效、功能多样性且兼具稳定性的菌株以应对污水水质、操作条件差异大的现象以及提高污水处理能力，加强生物强化技术应对环境变化具有重大意义。为分析高效菌株对污水的处理效果，本研究以武夷山市污水处理厂水样为采样点，采用人工配置模拟污水，通过液体培养法研究不同初始质量浓度下各菌株对综合性污水中TN、NH4+-N、COD和TP的去除规律，筛选对综合性污水中上述污染物去除能力较好的高效菌株，并进一步探讨污水质量浓度和处理时间对菌株净化污水效果的影响，从而为城市综合污水处理系统中高效菌种的选择提供依据，也为生物强化技术的提升、多功能的微生物菌剂研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

采样地位于武夷山市生活污水处理厂（118°00′33″E，27°44′00″N）的人工湿地。室内试验地在“福建省高校森林生态系统过程与经营重点实验室（福建农林大学）”进行。

1.2 试验材料

1.2.1 供试菌株

选择武夷山市生活污水处理厂人工湿地再力花、香根草、花叶芦荻3种植物的根际土壤（表1），通过提取、分离、筛选和鉴定等步骤从根际土壤中得到5株对污水处理相对高效的细菌Bacillus cereus（B1）、Bacillus thuringiensis（B2）、Bacillus megaterium（B3）、Bacillus thuringiensis（B4）、Bacillus cereus（B5）和5株高效真菌Westerdykella dispersa（F6）、Aspergillus niger strain（F7）、Penicillium janthinellum strain（F8）、Aspergillus iizukae（F9）、Paecilomyces lilacinus strain（F10）。

表1 湿地系统的基础地力Table 1 Soil fertility of wetland system

1.2.2 供试污水

参照武夷山市生活污水处理厂和工业污水处理厂进水水质，用KH2PO4、葡萄糖、蛋白胨和硫酸铵标准溶液、超纯水模拟配置不同质量浓度的模拟污水（Wiebner et al.，2005；袁东海等，2004；范彩彩，2013），详见表2。

表2 不同质量浓度污水各项指标质量浓度Table 2 The mass concentrations of indicators of different mass concentration wastewater mg·L−1

1.3 试验设计方法及处理

1.3.1 试验设计

将筛选获得的5株高效细菌（B1、B2、B3、B4、B5）和5株高效真菌（F6、F7、F8、F9、F10）分别接种于 50 mL灭菌的牛肉膏-蛋白胨液体培养基和改良马丁液体培养基中，在29 ℃、160 r·min−1条件下震荡培养 24—72 h，然后将菌液离心（10000 r·min−1，4 ℃）5 min，弃去上清液，用无菌超纯水洗涤菌体3遍，离心后弃去上清液用无菌超纯水稀释菌体，并用分光光度法（细菌）和血球计数法（真菌）制成 5×106CFU·L−1的菌悬液。

试验设置3个污水质量浓度梯度处理（表2）。取0.5 mL菌悬液加入200 mL灭菌的不同质量浓度污水中，每个处理组设3个重复，以无菌超纯水作对照，在 29 ℃、114 r·min−1恒温震荡培养箱中震荡培养。在12、24、36、48 h分别测定污水中TN、NH4+-N、COD和TP的含量。

1.3.2 指标测定方法

TN用GB/T 11894—1989碱性过硫酸钾紫外分光光度法测定；NH4+-N用纳氏试剂光度法质量浓度测定；COD用快速分光光度法测定；TP采用GB/T 11893—1989钼酸铵分光光度法测定。

1.4 数据分析

采用SPSS 19.0、Origin 18专业版软件进行数据处理、分析及图形绘制。用单因素方差分析（Oneway ANOVA）和多因素方差分析（Multi-Facto ANOVA）进行方差分析，并采用最小显著差异法为（LSD法）进行显著性检验和多重比较，显著性水平0.05。对菌株的吸附过程进行方程拟合。

去除率（谢武明等，2020）参见如下：

式中：

ρ0——溶液中TN、NH4+-N、COD和TP离子初始质量浓度 ρ0/(mg·L−1)；

ρt——吸附时间为 t时的质量浓度 ρt/(mg·L−1)。

2 结果与分析

2.1 高效菌株对不同质量浓度污水中的TN净化效果

菌株对TN有较好的处理效果（图1）。各菌株处理下的不同质量浓度污水中TN质量浓度大小均随着时间推移呈下降趋势，均低于CK；在相同质量浓度污水中，不同菌株之间对于TN的去除效果有着显著的差异；随着污水质量浓度的降低，TN质量浓度也随之减小。菌株对于高质量浓度污水去除48 h后 TN去除率表现为：F9>F7>B4>B3>F10>B2>F8>B5>B1>F6>CK，去除率为53.75%—75.73%，菌株F9在处理48 h后污水质量浓度最低（9.71 mg·L−1），其次是菌株F7（10.01 mg·L−1）和B4（10.78 mg·L−1）；中质量浓度污水中，各菌株对 TN的去除率在58.00%—80.67%之间，表现为：B3>F8>F9>B4>F7>F10>B1>B2>F6>B5>CK，处理48 h后，菌株B3（5.80 mg·L−1）和 F8（5.83 mg·L−1）去除效果最好；低质量浓度污水中，菌株B4处理下污水TN质量浓度呈下降-上升-下降的趋势，菌株F9处理下TN质量浓度呈下降-上升-下降的趋势，其他处理污水 TN 质量浓度均随着时间推移呈下降趋势，其表现为：B4>F7>B3>B2>F10>F6>F9>F8>B5>B1>CK，去除率为58.65%—74.55%，其中 B4去除效果达 5.09 mg·L−1。

图1 各菌株处理下及未有菌株处理下污水中TN质量浓度大小变化Fig. 1 Changes of TN mass concentration in swage with and without bacteria treatments

2.2 高效菌株对不同质量浓度污水NH4+-N的净化效果

菌株对NH4+-N的处理效果良好（图2）。在3个质量浓度的污水中，各菌株处理下NH4+-N质量浓度的总体变化趋势相一致，随着时间增加依次大幅减小。在同一质量浓度污水中，不同菌株处理下NH4+-N质量浓度的动态变化有较大差异（P<0.05）。菌株对不同质量浓度污水中的NH4+-N去除效果表现为：中质量浓度>低质量浓度>高质量浓度>对照组。各菌株对高质量浓度污水处理48 h后，NH4+-N去除能力表现为：F7>F8>F10>B4>B5>B2>B3>F8>F6>B1>CK，去除率为33.00%—63.98%，菌株F7处理48 h后NH4+-N质量浓度最低（8.64 mg·L−1）；中质量浓度污水中，各菌株去除能力表现为：F10>B4>F9>F7>B5>B3>B2>F8>B1>F6>CK，去除率为27.5%—72.05%，菌株F10处理的NH4+-N质量浓度最低（5.03 mg·L−1）；低质量浓度污水中，各菌株去除能力表现为：B4>F10>B5>F7>F9>B3>B2>F8>F6>B1>CK，去除率为 35.36%—65.54%，其中菌株 B4处理下污水中NH4+-N质量浓度最低为4.13 mg·L−1。上述表明菌株F7、F10和B4分别对高、中和低质量浓度污水中NH4+-N的去除能力较好。

图2 各菌株处理下及未有菌株处理下污水中NH4+-N质量浓度大小变化Fig. 2 Changes of NH4+-N mass concentration in swage with and without bacteria treatments

2.3 高效菌株对不同质量浓度污水 COD的净化效果

菌株对污水 COD净化效果趋势与 NH4+-N和TN相同（图3）。在同一个质量浓度污水中，各菌株处理下的COD质量浓度变化有着显著的差异性。具体表现出：高质量浓度污水中，经过48 h处理后，各菌株去除能力表现为：F9>F7>B1>B3>F6>B5>F10>B4>F8>B2>CK，去除率为36.55%—62.14%，菌株F9处理48 h后COD质量浓度最低（151.41 mg·L−1）；中质量浓度污水中，降解能力表现为：F9>F10>B3>B1>F7>F6>B5>B4>F8>B2>CK，去除率为 39.91%—68.96%，菌株F9处理下污水中COD质量浓度最低（93.11 mg·L−1）；低质量浓度污水中，其去除能力表现为：B1>F7>B3>F9>F6>F10>B5>F8>B4> B2>CK，去除率为40.5%—66.85%，菌株B1适于低质量浓度污水中COD的去除，处理48 h后污水中COD去除率最高。上述表明，3个质量浓度的污水中，各菌株对 COD的去除率从大到小排列为：低质量浓度>中质量浓度>高质量浓度>对照组，且B1和F9分别是高、中质量浓度下污水中 COD的去除能力较好菌株。

图3 各菌株处理下和未有菌株处理下污水中COD质量浓度的变化Fig. 3 Changes of COD mass concentration in swage with and without bacteria treatments

2.4 高效菌株对不同质量浓度污水TP的净化效果

大多数菌株处理下的 TP质量浓度低于对照组（图4）。同质量浓度的污水中，菌株对TP的去除效果显著差异。各菌株在高质量浓度污水中处理48 h后去除能力表现为：F7>F9>B3>F30>B1>B4>F6>F8>B2>B5>CK，去除率为22.15%—50.15%，其中菌株F7处理下污水中 TP 质量浓度最低（1.496 mg·L−1），去除率最高，菌株F9和B3的去除效果也较好；中质量浓度污水中，去除能力表现为：F7>F9>F8>F10>B1>B4>B2>B3>F6>B5>CK，去除率为 33.71%—50.16%，菌株F7处理48 h后污水TP质量浓度最低（0.997 mg·L−1），F9（1.021 mg·L−1）和 F8（1.076 mg·L−1）次之；低质量浓度污水中，F7>B2>F10>F9>B3>B1>B4>F6>B5>F8>CK，去除率为 32.28%—52.15%，菌株F7对TP的去除效果最好，在处理48 h后，TP质量浓度最低（0.479 mg·L−1）。上述表明菌株F7对TP的处理效果最佳。

图4 各菌株处理下和未有菌株处理下污水中TP质量浓度的变化Fig. 4 Changes of TP mass concentration in swage with and without bacteria treatments

多因素方差分析（表3）表明，不同菌株处理与污水质量浓度之间、不同菌株处理与处理时间之间、污水质量浓度与处理时间之间以及它们三者之间均存在显著的交互作用，即不同处理时间、不同污水质量浓度均对菌株处理下污水中TN、NH4+-N、COD、TP的去除有显著影响。在3个污水质量浓度中，各菌株处理的去除率均显著高于CK，表明这些高效菌株能够显著提高污水中的净化，但整个试验过程中存在污水质量浓度梯度和时间梯度，菌株对 TN、COD、NH4+-N的去除效果在中质量浓度和48 h最优，对TP的去除效果在低质量浓度和48 h最优。

表3 不同菌株处理下TN、NH4+-N、COD、TP质量浓度的动态变化的多因素分析Table 3 Multi-factor Analysis of the dynamic changes of TN, NH4+-N, COD, TP mass concentration in different strains

2.5 高效菌株处理不同时间去除效果分析

真菌菌株处理效果优于细菌菌株处理（图5）。随时间增加，去除率随之提高，48 h去除效果最好。真菌（12.70%—55.27%）优于细菌去除（10.43%—52.14%）。12—36 h间各菌株去除率呈现较均匀的增长趋势，其中，细菌菌株处理下的 TN、NH4+-N去除效果略好于COD、TP；真菌处理下的TN、COD?去除效果要好于NH4+-N、TP。36—48 h，菌株对污水的净化效果明显增加，TP的去除较于其余三者趋于缓慢增加。第36小时时，细菌菌株对NH4+-N去除率（42.67%）暂时大于对TN去除率（39.79%），处理时间延长TN去除率大幅增大至第48 h时不同污染物去除率高低顺序为：TN (66.78%)>NH4+-N(54.07%)>COD (51.23%)>TP (36.47%)。真菌菌株降解48 h时顺序为TN (68.57%)>NH4+-N (55.78%) 和COD (55.52%)>TP (41.20%)。可得，细菌和真菌对TN降解效果最佳，对NH4+-N平均去除率次之，菌株对污水的含氮有机物去除效果好。

图5 不同处理时间下真菌与细菌的平均降解率Fig. 5 The average degradation rate of fungi and bacteria under different treatment time

为更好揭示菌株对污水有机物的去除过程，基于细菌与真菌平均去除率变化趋势线，本研究拟合一个多项式模型表（表 4），为细菌与真菌菌剂的制作以及复合菌剂的研发提供一定价值参考。

表4 细菌与真菌拟合模型表Table 4 Fitting model table of bacteria and fungi

3 讨论

3.1 各菌株对TN去除效果分析

不同菌株对污水中TN去除效果显著。经过48后，各菌株处理下TN质量浓度均低于CK、去除率均显著高于CK，高、中、低质量浓度污水中，去除率相比CK分别提高了74.92%、80.67%和74.35%侯庆杰等（2011）研究结果表明加菌后脱氮率最大可提高 98%，进一步验证了菌株可显著提高对 TN去除效果。B3处理的高、中、低质量浓度的污水中TN质量浓度在24—36 h间有呈先升后降，这由于初始阶段污水溶解氧含量多，反硝化作用受到抑制，污水中多以硝化作用产物亚硝酸根离子和硝酸根离子暂时性的存在于水体中，TN含量没有减少反而增加，这表明菌株B3具有好氧和兼性厌氧菌的特性。不同菌株对TN的去除效果差异显著，此结果与Zhang et al.（2019）研究结果相似。原因，（1）菌株自身差异。香根草根际土的养分含量明显高于再力花和花叶芦荻的根际土（表 1），所提取的菌株自身条件不同。此外，3种湿地植物根系分泌物也会有所差异，影响微生物物种组成、数量和代谢能力大小（王林等，2017）。（2）菌株降解机制复杂，特别氮代谢机制存在差异。本实验显示各质量浓度污水不同菌株和阶段TN去除效果存在差异，说明在各阶段中菌株主机制不同。TN以硝态氮和氨态氮存在于污水中，氨氮由硝化作用转变为硝酸盐和亚硝酸盐，再经反硝化作用转变为氮气或氨。（3）污染物复杂的成分和结构等因素也影响污水处理效果（Megharaj et al.，2011）。污水包含N、P等非金属元素和有机物等污染物质，在微生物作用下形成一个复杂的动态循环。随着时间推移，各菌株在降解污染物过程中分泌物质的数量和种类差异大，同时污水水力条件随之变化，它们反过来影响微生物降解效果。

3.2 各菌株对NH4-N去除效果分析

微生物对污水中NH4+-N的降解效果优良。10株菌株平均去除率为38.44%—64.64%，各菌株处理下的NH4+-N质量浓度均低于CK，48 h降解效果最佳，去除率相比CK分别提高了38.28%、43.36%和39.28%。刘飞等（2007）向养殖污水添加枯草芽孢杆菌发现NH4+-N质量浓度有明显降低趋势，表明投加菌株对 NH4+-N去除效果显著。微生物对于NH4+-N的去除主要有硝化、反硝化和氨化作用等过程。菌株 B4去除 NH4+-N效果最好，去除率可达79.33%，说明其硝化和反硝化作用强，能及时将产生的亚硝酸盐和硝酸盐转化为 N2或 NH3，降低NH4+-N质量浓度。各菌株在中质量浓度污水的处理效果要好于高和低质量浓度，表明菌株处理的最佳效果对污水质量浓度有一定要求。污水质量浓度高对微生物产生毒害作用，降低微生物及其水解酶的数量和活性，影响菌群组成等特性，导致去除能力降低（赵艳，2012）。而且，氨氮等含氮化合物质量浓度超过一定数值时，氨氧化作用被抑制，去除效果差。这与郭星等（2019）发现厌氧氨氧化反应表明氨氮和硝态氮质量浓度大小与厌氧氨氧化细+菌代谢关系呈非线性关系以及金春英等（2019）发现不同质量浓度的氨氮最大去除率范围为 35%—96%结论一致。菌株B4、F7、和F9分别在24—36 h和36—48 h期间出现NH4+-N质量浓度先增后逐渐降低，这可能是因为：（1）氨氮质量浓度影响。初始阶段时，氨氮质量浓度大，游离氨质量浓度大，对硝酸菌起到抑制作用，硝化作用受到抑制，故污水氨氮质量浓度呈现暂时增大，随硝酸盐和亚硝酸盐积累，反硝化作用增加，氨氮质量浓度减小（支霞辉等，2009）。（2）菌株去除污水中TN、NH4+-N等过程中，一部分被微生物同化供自生生长繁殖，随时间延长，可能发生细胞基质组成变化或细胞死亡，被同化的氮元素被释放出来，回到污水中（Ahemad et al.，2014）。（3）处理时间的影响。随时间增大，污水水质发生变化，如溶解氧、有机物被大量消耗，不满足个别菌株生长要求，菌株去除能力减弱。

3.3 各菌株对COD去除效果分析

菌株对污水COD的去除表现出较好效果。COD通常用于表示水中有机物含量，是衡量水体有机污染物污染程度的重要指标。质量浓度过高易引起水体有害生物生长繁殖，给水域生态造成不良影响，须加以控制。微生物分解作用是生活污水中COD去除的主要过程，有分解代谢和合成代谢2种形式（叶春松等，2019）。研究发现，各菌株对不同质量浓度污水COD的净化效果差异显著，本研究中F9是高、中质量浓度下去除COD的优势菌株，B1是低质量浓度下去除 COD的优势菌株，各菌株处理的污水中COD去除率高于CK，48 h去除效果最佳。叶姜瑜等（2017）研究表明在聚甲醛废水中投加复合菌剂结果显示COD去除率达92.6%以上；王书亚等（2019）在藻菌共培养体系筛选优势菌株中发现，细菌与小球藻共培养体系中沼液 COD去除率72.3%，诸多研究表明施加菌株可显著提高污水中COD的去除率。一方面是添加的菌株直接或者间接对污染物进行了降解利用；另一方面增加活性污泥絮凝吸附能力（朱胜杰等，2017）。菌株B4在24—36 h期间、菌株F8在36—48 h间有上升的趋势。一是微生物对有机物降解的同时会产生有机酸等分泌物而改变水中pH值，进而改变细胞膜电荷，影响微生物对营养物质的吸收，降低微生物和酶的活性，导致微生物降解能力下降，致使污染物质量浓度小幅回升（赵曦，2006）。二是一定数量的微生物产生水解酶的数量一定，有机物数量超过一定范围时，酶活性下降，呈现后期短幅回升现象。

3.4 各菌株对TP去除效果分析

微生物对污水中TP有一定去除效果。各菌株去除率分别为 22.15%—50.15%（H）、33.71%—50.16%（M）、32.28%—52.15%（L），略低于菌株对TN、NH4+-N、COD的降解。一方面由于微生物降解有机物主要通过分泌酶来完成的，而酶作用具有专一性（杜聪等，2018），表明菌株对污染物的去除存在一定的选择性，本实验显示菌株B4和B3较易降解TN和NH4+-N，说明菌株B4和B3分泌酶对含氮有机物或化合物降解效果好；另一方面反硝化作用强于聚磷菌除磷作用，多种作用机制的同时进行，中间产物如NO3−的存在，使得反硝化菌与聚磷菌形成竞争关系。TP是加剧环境水体富营养化、加重水污染的主要因素之一（Liu et al.，2018）。生物除磷是利用聚磷菌类（唐伟等，2019）的微生物，在厌氧-好氧交替培养下达到净化的效果。本研究中，F7是各质量浓度下除 TP的优势菌株。F7、B2处理中质量浓度污水 24—36 h间呈现大幅度上升趋势，可能与TP的质量浓度有关，有研究指出，当TP质量浓度大于0.5 mg·L−1时，基质吸附是首要去除机制，当质量浓度低于0.25 mg·L−1时，微生物除磷更为重要（Martínm et al.，2013）。

3.5 根际菌株吸附各离子的拟合模型

真菌和细菌吸附TN、NH4+-N、COD和TP在过程动态规律上差异显著。二者的方程拟合效果均良好，其中真菌倾向于幂指数模型而细菌则倾向于多项式模型。细菌在吸附过程中出现了极大值，说明细菌的吸附能力随时间变化先增加后下降，这可能是细菌个体结构简单，吸附污染物质的手段有限且采用的是一种消耗式吸附方式；而真菌个体更大，个体结构更为复杂，存在多种吸附机制，在一定质量浓度范围内吸附污染物质的同时自身有一定的自我修复能力，具备了可持续吸附的潜力。二者相关的机制均需要深入研究。

本研究的是各单一菌株对于不同质量浓度污水的效果，筛选最佳菌株。但未涉及处理过程中污水中好氧与厌氧的条件变化、pH值变化以及优势菌株的固定化和稳定性等问题对菌株的影响。另外，多种菌株共同作用处理和复合菌株对污水处理机制及研发长时间的菌剂等问题，今后须加以深入研究。

4 结论

利用高效菌株去除污水污染物是一条可行高效、低成本途径。10株菌株对污水TN、NH4+-N、COD和 TP去除效果显著，相比 CK分别提高了80.67%、72.05%、68.96%、52.15%。

各菌株的去污能力在时间轴上多为单峰曲线，其研究仍有待进一步深入。各菌株对TN、NH4+-N、COD和TP的去除具有差异性。经过对比、筛选得去除TN的优势菌株为F9、B3和B4；去除NH4+-N的优势菌株为 F7、F10、B4；菌株 F9、B1是去除 COD效果最好；F7是各质量浓度下除TP的优势菌株。菌株B4对污水TN、NH4+-N去除率较高，适用于一般的生活污水；菌株F9、F7对各污染物去除效果均良好，具有净化综合性污水潜力。拟合模型表明，细菌菌株平均去除率符合多项式模型，真菌菌株平均去除率符合幂指数模型。真菌处理（55.27%）优于细菌处理（52.14%）。