聚酰胺用于选择性激光烧结3D打印截骨导板的性能研究

项巍巍，黄野，刘国彬，柳剑，张名俊，王卿，雷鹏坤，王郁琪，王小龙，万翔*

[(1.强生(苏州)医疗器材有限公司，江苏 苏州 215126；2.北京积水潭医院，北京 100035；3.河北医科大学第一医院，河北 石家庄 050000；4.强生(上海)医疗器材有限公司，上海 200030)]

聚酰胺材料通过选择性激光烧结技术加工成型，是3D打印截骨导板常用的一种加工方式。3D打印截骨导板在手术中起定位、导向和保护的作用，会与骨表面直接接触。导板设计需要与手术部位相匹配，满足力学性能的要求[6]。应使用具有一定硬度、韧性、受力后不易变形的材质[7]，且在使用前需要对导板进行灭菌，制造导板的材料应生物相容性检测合格。

然而，目前针对3D打印截骨导板及其材料的相关标准尚不完善，关于3D打印截骨导板的材料要求也不明确。因此，本文针对目前广泛应用于医疗3D打印的聚酰胺材料进行了机械性能、化学性能、生物学相容性的研究。

1 资料与方法

1.1 试验用材料和仪器

1.1.1 机械性能测试 测试样品为强生(苏州)医疗器材有限公司使用EOS P110 3D打印机，由高分子聚酰胺材料打印，再经132℃、4 min高压蒸汽灭菌的截骨导板。参考国家标准设置拉伸性能测试(包括断裂延伸率、拉伸模量和抗拉强度)、维卡软化温度测定、负荷变形温度测试和滚动磨损实验。拉伸性能测试设置30个试样，狗骨状试件宽度(10.0±0.2)mm，厚度(4.0±0.2)mm，初始夹具间距(115.0±1.0)mm。维卡软化温度测定实验设置15个试样，为厚3.0～6.5 mm，边长10 mm的正方形。负荷变形温度测试设置15个试样，横截面为矩形，长度为80 mm，宽度为10 mm，厚度为4 mm的样条。滚动磨损实验设置6个试样，为直径100 mm的圆形。

1.1.2 化学性能测试 按样品质量0.2 g加1 mL的比例加水，在(37±1)℃放置24 h，分离液体，冷至室温，作为检验液。

仪器：电子天平(AL104，梅特勒-托利多，中国)，pH计(310p-01A，奥力龙，中国)，电热恒温干燥箱(DHG-9147A，上海精宏，中国)，紫外可见分光光度计(Cary，Agilent Technologies，德国)。

该项目中所使用的是电阻应变式称重传感器，该传感器由金属应变弹性本体、套筒和与其相连的电阻应变片构成，结构如图1所示。

试剂：硫代硫酸钠(永华化学科技)，pH缓冲溶液(Thermo)。高锰酸钾，硫酸，碘化钾，淀粉，乙酸胺，盐酸，硫代乙酰胺，硝酸铅，氢氧化钠，丙三醇(甘油)，硝酸。以上试剂均来自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 生物相容性评估试验

1.1.3.1 细胞毒性试验 将样品和浸提液[10%胎牛血清的低限基本(minimum essential medium，MEM)]培养液按照样品表面积与浸提液比为3 cm2/mL置于37℃恒温浸提24 h备用。小鼠成纤维细胞L929(来自美国菌种保存中心)。仪器：高压灭菌器(YXQ-LS-50，上海博迅，中国)，倒置显微镜(CKX31，OLYMPUS，日本)，酶联免疫检测仪(PowerWave XS2，BIO-TEK，美国)。试剂：噻唑兰[3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-Diphenyltetrazolium Bromide，MTT](SIGMA)、胎牛血清(CORNING)、胰酶(GiBco)。

1.1.3.2 皮肤致敏试验 动物采用哈特兰豚鼠30只[苏州镇湖实验动物科技有限公司，SCXK(苏)2015-0007]，体重300～500 g，雄性。仪器：卧式大容量恒温振荡器(SPH-111B，上海世平实验设备，中国)，压力蒸汽灭菌器(LMQC-50E，山东新华，中国)。试剂：0.9%氯化钠注射液(辰欣药业股份有限公司)；芝麻油(吉安市绿源天然香料油提炼厂)；2，4-二硝基氯苯(2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB)(Xiya Reagent)；弗氏完全佐剂(SIGMA)。阳性对照组：溶剂为0.9%氯化钠(Sodium chloride，SC)注射液或芝麻油(Sesame oil，SO)，诱导浓度为0.5% DNCB，激发浓度为0.1% DNCB；阴性对照组：0.9%氯化钠注射液；芝麻油。供试液：用0.9%氯化钠注射液或芝麻油作为浸提液，浸提比例为3 cm2/mL，37℃浸提72 h。浸提完成后4℃保存，24 h内用于测试。

1.1.3.3 皮内反应试验 主要仪器同1.1.3.2新西兰白色纯种大白兔3只[苏州镇湖实验动物科技有限公司，SCXK(苏)2015-0007]，雌性，体重不低于2kg。试剂：0.9%氯化钠注射液(辰欣药业股份有限公司)；芝麻油(吉安市绿源天然香料油提炼厂)；十二烷基硫酸钠(Solarbio)。阴性对照液：极性对照为0.9%氯化钠注射液，非极性对照为芝麻油。阳性对照液：极性对照为20%十二烷基硫酸钠溶于0.9%氯化钠注射液；非极性对照为20%十二烷基硫酸钠溶于芝麻油。供试液：使用0.9%氯化钠注射液或芝麻油作为浸提液，浸提比例为3 cm2/mL，37℃浸提72 h。浸提完成后4℃保存，24 h内用于测试。

1.2 试验方法

1.2.1 机械性能测试 拉伸试验参考GB/T 1040.1-2006塑料拉伸性能的测试。实验室环境条件为(23±2)℃。利用夹具将试件两端夹紧后，使试验机以50 mm/min的速度加载，直至试件断裂。维卡软化温度测试参考GB/T 1633-2000热塑性塑料维卡软化温度的测定。受试材料的维卡软化温度为试样维卡软化温度的算数平均值。负荷变形温度测试参考GB/T 1634.1-2004塑料负荷变形温度的测定。以(120±10)℃/h的均匀速率升高热浴的温度，记下样条初始挠度净增加量达到标准挠度时的温度，即为在GB/T 1634有关部分规定的弯曲应力下的负荷变形温度。受试材料的负荷变形温度为试样负荷变形温度的算数平均值。滚动磨损试验参考GB/T 5478-2008塑料滚动磨损试验方法。

1.2.2 化学性能测试 参考GB/T14233.1-2008医用输液、输血、注射器具检验方法，第一部分第5章节检验液溶出物分析方法中的5.2、5.4、5.5、5.6、5.7，分别测定检验液的还原物质、酸碱度、蒸发残渣、重金属总量和紫外吸光度。

1.2.3 生物相容性评估试验 根据GB/T16886.1-2011医疗器械分类，3D打印骨科导板属于外部接入器械，接触时间为A类短期接触，即在24 h以内1次、多次或重复使用或接触的器械。因此该生物相容性评估试验包括细胞毒性、皮肤致敏及皮内反应。

参照细胞毒性测试-体外法GB/T 16886.5-2017标准执行。将浸提液按照100%、75%、50%、25%的浓度用培养液稀释，阳性对照样品为1%二乙基二硫代氨基甲酸锌的10%胎牛血清MEM溶液，浸提液浓度为0作为阴性对照组，空白对照样品为浸提液。每组做5个平行样。

将处于对数生长期的L929细胞制备成单细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/mL。接种上述细胞悬液到96孔板中，每孔100 μL，37℃，5% CO2，>90%湿度培养24 h。待细胞长成单层后，吸出原来的培养液，分别加入100μL试验样品浸提液(100%，75%，50%，25%)、空白对照液、阳性对照液和阴性对照液。每组做5个平行样。

培养24 h后，取出96孔板先做细胞形态学观察。然后每孔加50 μL MTT(1 mg/mL)，培养2 h，吸弃上清，加100 μL异丙醇溶解结晶。在酶标仪上以570 nm为主吸收波长，650 nm为参考波长测定吸光度值。

1.2.3.2 皮肤致敏试验 参照刺激与皮肤致敏试验GB/T16886.10-2017标准执行。(1)皮内诱导阶段。在每只动物去毛的肩胛骨内侧部位从头部向尾部成对进行A、A、B、B、C、C共3对6个点，皮内注射0.1 mL。A：弗氏完全佐剂与选定的溶剂以50∶50(V/V)比例混合的稳定性乳化剂。B：注射试验样品(未经稀释的浸提液)；对照组动物仅注射相应溶剂。C：试验样品(部位B中采用的浓度)，以50∶50的体积比例与弗氏完全佐剂与溶剂(50%)配制成的乳化剂混合后进行皮内注射；对照组动物注射对照液与佐剂配置成的乳化剂。(2)局部诱导阶段。按B的最大浓度未产生刺激反应，在局部敷贴应用前(24±2)h，试验区用10%十二烷基硫酸钠进行预处理。皮内注射后7 d用0.5 mL供试品浸提液浸透覆盖诱导注射点。采用封闭式包扎带固定样品，随后于(48±2)h后去除。对照组动物使用对照液同法操作。(3)激发阶段。于局部诱导后14 d对全部动物进行激发。用0.5 mL供试品浸提液和对照液浸透后的吸收性纱布块分别局部贴敷于诱导阶段未试验部位，采用封闭式包扎带固定，随后于(24±2)h后去除。(4)结果评价。除去样品后(24±2)h和(48±2)h，在全光谱光线下观察动物激发部位皮肤情况。按照Magnusson和Kligman分级标准对每一激发部位和每一观察时间皮肤红斑和水肿反应进行描述并分级。

1.2.3.3 皮内反应试验 参照刺激与皮肤致敏试验GB/T16886.10-2017标准执行。将兔背部脊柱两侧的背毛除去，作为试验观察的部位。在兔背一侧注射0.2 mL样品SC浸提液和0.2 mL样品SO浸提液；另一侧同样注射0.2 mL SC阴性对照液和0.2 mL SO阴性对照液。观察即时、(24±2)h、(48±2)h和(72±2)h注射局部及周围皮肤组织反应，记录包括红斑、水肿和坏死等情况。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0统计学软件，对断裂延伸率、拉伸模量、拉抗强度、维卡软化温度、负荷变形温度和磨损重量损失采用单样本t检验；P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 机械测试结果

2.1.1 分析结果 断裂延伸率、拉伸模量、抗拉强度、维卡软化温度、负荷变形温度和磨损重量损失的数据样本均值与总体均值之间比较，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)[8]。证明表中数据间差异不是由抽样引起的，即实验处理有效[9]。

表1 机械性能数据

2.2 化学测试结果 测定检验液中的还原物质消耗0.002 mol/L KMnO40.4 mL；检验液与空白溶液pH差值为1.4；重金属总含量(以pb2+计)<1.0 μg/mL；蒸发残渣为0.6 mg；紫外吸光度为0.008。测试结果符合GB19335-2003中第3章节对以上5项的要求。

2.3 生物相容性试验结果

2.3.1 细胞毒性试验结果 接种细胞前和加浸提液前生长状态良好；加浸提液24 h后，阳性对照组细胞裂解死亡；空白对照组、阴性对照组、样品浸提液组(100%，75%，50%，25%)生长状态良好。24 h细胞活力结果见表2。细胞形态观察和细胞活力的试验结果显示样品浸提液对小鼠成纤维细胞无潜在毒性影响。

表2 24 h细胞活力结果

2.3.2 皮肤致敏试验结果 实验组激发后阳性发生率为0；阳性对照组阳性发生率为100%，阴性对照组发生率为0。实验组和阴性对照组豚鼠斑贴部位皮肤未出现红斑和水肿；阳性对照组斑贴部位皮肤出现明显红斑和水肿。豚鼠皮肤致敏试验中未见样品浸提液对豚鼠引起皮肤致敏反应。

2.3.3 皮内刺激试验结果 实验过程中动物未出现异常症状或死亡。试验样品组极性和非极性浸提液皮内反应均未超过对照组。样品的极性和非极性浸提液在兔皮肤内未发现皮内刺激反应。

3 讨 论

随着我国人口老龄化，骨关节炎多发，骨科临床医师对保膝治疗展现了极大的积极性[10]。近年来基于胫骨高位内侧截骨术的保膝手术被证明是治疗早期骨关节炎的有效手段。然而此类手术需要一定的学习曲线，术中需要借助医者的经验积累，多次透视调整以获得理想的截骨位置，导致手术时间延长，增加出血量、X线辐射，以及术后并发症等都会影响手术效果。数字化3D打印技术应用于胫骨高位截骨术领域，可以帮助克服以上缺点，从而使得胫骨高位截骨手术得到更好的应用[11]。

目前已有多种材料用于3D打印导板，例如：丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(acrylonitrile butadiene styrene copolymers，ABS)、光敏树脂、聚酰胺、金属等[1，12]。ABS树脂成型的材料韧性好，但精度较低，适用于制备大体积的导板，如脊柱经皮导板[13]；光敏树脂材料成型精度高，强度适中，在口腔医学领域应用广泛[14]；聚酰胺具有成型温度低、所需激光功率小的优点，而且受力后不易变形，可消毒，适合用于制备小体积并对强度有要求的导板[15]；金属材料包括钛合金、医用不锈钢、铝合金等，具有高精度和高强度，可加工成用于引导钻头、摆锯和骨刀的导板[16]。打印材料和增材制造技术的选择很大程度上取决于预期用途，不同3D打印技术制备的手术导板各有优势，需根据具体手术方式进行选择[17]。

通过本研究中所涉及的实验，可以证明聚酰胺选择性激光烧结3D打印截骨导板表面硬度大且成型后形变温度高，正常条件下使用时能保持良好且稳定的机械性能[18]。其化学性能符合国标一次性使用血路产品通用技术条件对相关测试项目的要求。材料无明显细胞毒性、皮肤致敏和皮内刺激反应，符合国标对于组织或骨短期接触的外部接入器械的生物安全性的要求。但聚酰胺3D打印截骨导板在临床应用中仍然存在一些问题，如术中使用摆锯沿着导板进行操作时的高频振动容易使导板产生粉碎颗粒，在沿截骨槽进行切割时也有可能使其断裂[19]。此外由于聚酰胺材料粉末细小且不能被机体吸收，残留在患者体内是否存在安全隐患还有待临床长期随访研究[20]。

综上所述，3D打印聚酰胺材料能够发挥3D打印导板数字化制作高效率的优势，其机械性能良好，化学性能和生物相容性都符合相关要求，具有良好的临床应用前景。

感谢苏州大学环境研究所在3D打印截骨导板性能测试试验中给予的帮助和指导。