基于网络药理学研究小柴胡汤治疗乙型肝炎的作用机制

蓝绍航， 唐秋媛,， 李娜娜， 陶 然， 廖南盛， 蒙荫杰， 何 草， 毛德文,

1 广西中医药大学 研究生院， 南宁 530001； 2 广西中医药大学第一附属医院 肝病科， 南宁 530023

乙型肝炎是由HBV引起，以肝脏损害为主要临床表现的一组全身传染性疾病[1]。据统计[2]，我国每年约有30万人死于乙型肝炎相关性疾病。目前，西医在临床中治疗乙型肝炎多使用恩替卡韦、富马酸替诺福韦等药物[3]，虽可延缓病情，但有耐药风险，远期预后不佳[4]。中医药治疗乙型肝炎经验丰富，安全性高。其中出自张仲景《伤寒论》中的名方小柴胡汤具有疏肝利胆、和解少阳的功效，临床中常用其治疗肝郁脾虚证乙型肝炎。现代药理学也表明，小柴胡具有显著的抗肝损害、抗炎、抗癌及免疫调节等多种作用[5]。

目前学界内对于小柴胡汤治疗乙型肝炎有不少研究，但尚未对其作用机制进行系统阐释。网络药理学是基于系统生物学、药理学和药物化学的一门综合性新兴学科，打破了传统的“一个药物，一个靶标，一种疾病”的思维模式及框架[6]，与中医治疗疾病的整体观念和辨证论治原则相符[7]，是中药发展与研究的新模式[8]。同时，分子对接可揭示药物治疗疾病的分子机制，将药理作用上升到分子水平，为药物机制研究奠定物质基础[9]。因此，本研究基于网络药理学结合分子对接技术，深入阐述小柴胡汤多成分、多靶点、多生物学过程、多通路的协同治疗乙型肝炎的作用机制，为进一步的实验研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 药物有效成分筛选及靶点预测 在中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)筛选小柴胡汤(柴胡、黄芩、人参、半夏、生姜、大枣、甘草)的全部化学成分，并以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性指数(DL)≥0.18为筛选条件，确定药物的活性成分；在Related Targets一栏中找出其所对应的作用靶点，将所有药物靶点进行合并整理，剔除重复靶点；在Uniport数据库(https://www.uniprot.org/)中输入靶点名称获取其对应的标准基因名。

1.2 乙型肝炎疾病靶点获取 以“hepatitis B、hepatitis B virus”为检索词，限制检索条件为“gene”“homo sapiens”，在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)数据库中获取乙型肝炎相关靶点基因。将筛选条件定为Relevance score≥10.0，对收集的所有乙型肝炎靶点进行处理，将所有靶点基因进行合并，删除重复靶点。

1.3 小柴胡汤与乙型肝炎交集靶点筛选 将上述获得的药物靶点交集与疾病靶点基因交集通过R语言绘制Venny图，得到药物与疾病交集靶点(Drug-Disease)。

1.4 构建活性成分-核心靶点网络 将上述所得的小柴胡汤所有药物的活性成分和乙型肝炎靶点基因交集数据导入Cytoscape3.7.2软件，并对其参数进行设置，得到活性成分-核心靶点相互作用网络图。

1.5 构建蛋白质相互作用(PPI)网络及核心基因预测 将筛选得到的“Drug-Disease”中的靶点蛋白导入STRING数据库(https://string-db.org/),限定研究物种为“Homo sapiens”，最低相互作用评分设置为“0.900”，同时设置隐藏游离点，其余参数保持默认，进行蛋白质互作分析，得到PPI网络图。将所得数据导入Cytoscape3.7.2软件，利用CytoNCA插件进行网络拓扑学分析筛选关键基因。

1.6 GO功能富集分析与KEGG通路分析 将筛选得到的“Drug-Disease”中的靶点蛋白通过R语言进行GO功能富集分析和KEGG通路分析，两者均以P<0.05为筛选指标(P<0.01被认定是富集显著，P值越小富集越显著)。

1.7 分子对接 将1.1节和1.5节中整理出degree排名靠前的活性成分与核心靶点进行分子对接。在Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载活性成分的小分子配体2D结构，再利用ChemBio3D Ultra 14.0软件生成3D结构，使用优化模块进行分子结构优化，获取最稳定的分子构象，并保存为mol2格式。从PDB(https://www.rcsb.org/)数据库下载靶点蛋白受体三维结构，文件保存为PDB格式并导入PyMOL软件，输入命令删除靶蛋白的水分子和小分子配体，完成蛋白受体准备。将蛋白受体文件导入AutoDock Tools-1.5.6软件中，对蛋白分子加氢及对非完整氨基酸等问题进行矫正，保存文件为pdbqt格式，再将小分子配体文件mol2格式导入AutoDock Tools-1.5.6软件中，把文件转换为pdbqt格式，最后使用Autodock vina软件进行对接并利用PyMOL软件进行可视化分析。

2 结果

2.1 小柴胡汤有效活性成分筛选及靶点预测 经TCMSP数据库搜索，检索到小柴胡汤7味药材的有效活性成分共有214个，其中柴胡17个、黄芩36个、人参22个、半夏13个、生姜5个、大枣29个、甘草92个，去重后共获得193个有效活性成分(表1)。将筛选到的193个有效活性成分基于TCMSP搜索并整理后共得到247个作用靶点。

2.2 药物靶点与疾病靶点交集 经分析得到药物潜在活性成分靶点247个，乙型肝炎疾病基因1655个，二者得出的交集靶点基因为142个(图1)。

图1 药物靶点和疾病靶点Venny图

2.3 活性成分-核心靶点相互作用网络 将2.2节得到的142个交集靶点运用Perl相关脚本进行文件处理，所得数据导入Cytoscape3.7.2软件进行可视化网络构建，得到活性成分-核心靶点相互作用网络图(附录1)。

表1 小柴胡汤部分活性成分信息

附录1中四周圆形节点代表药物的有效成分，橙、黄、绿、深红、粉红、灰、黑色分别代表小柴胡汤中的半夏、柴胡、大枣、甘草、黄芪、人参、生姜的有效成分，多个颜色代表多个药物共同的有效成分，灰色线条代表边，中间浅蓝色矩形节点代表中药和疾病的交集靶点。图中共有280个节点，其中来源于化合物的有138个，来源于基因的有142个；经统计degree较高的有效成分为槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、汉黄芩素(wogonin)、柚皮素(naringenin)等(表2)。

2.4 PPI网络及核心基因预测 将2.2节的142个交集靶点导入STRING数据库，设定物种为“Homo sapiens”，得出string_interactions文件，并以tsv格式保存。网络图共有142个节点、622条边，平均每个节点的度值为9.32，平均局部聚类系数为0.507，PPI enrichment p-value值为<1.0e-16，邻接节点数目越多，说明这些蛋白在网络中的作用越显著(附录2)。

将tsv格式文件数据导入Cytoscape3.7.2软件中，使用CytoNCA插件对PPI网络进行拓扑分析筛选关键基因，处于核心位置的靶点有RELA、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)1、TP53、ESR1、EGFR、AKT1、JUN、MAPK8、RB1、STAT3、MAPK3、MYC、MAPK14、CCND1等，提示这些基因在PPI中发挥了关键作用，可能是小柴胡汤治疗乙型肝炎的核心靶标基因(附录3)。

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析 共得到GO富集条目2612条，GO富集条形图主要展示生物过程(BP，共2375个)、细胞组分(CC，共60个)、分子功能(MF，共177个)前10条富集结果(图2)。KEGG通路分析得到174条富集结果，并绘制KEGG气泡图展示富集通路结果(仅对P值排序后取前30名进行展示，P值越小表明富集越显著，图3)。在对KEGG结果进行预读后发现，与小柴胡汤治疗乙型肝炎密切相关的通路有乙型肝炎通路、PI3K-AKT信号通路等。

图2 交集基因GO条形图

图3 交集基因KEGG点图

2.6 潜在活性成分-核心靶点分子对接分析 根据小柴胡汤“活性成分-核心靶点”网络中靶点与成分连接的度值，选取活性化合物中degree排名靠前的主要活性成分槲皮素、山奈酚、汉黄芩素、柚皮素，分别与经拓扑分析筛选后的关键核心靶点MAPK1、RELA、TP53、ESR1进行分子对接。一般认为配体和受体结合能越低结合力越好，结合能≤0 kcal/mol说明两者可以自发结合，结合能≤-5.0 kcal/mol说明有较好的结合力，结合能≤-7.0 kcal/mol说明结合构型具有强烈的活性[10-11]。结果表明以上主要活性成分与关键靶点的结合能均≤-7.0 kcal/mol，展现出良好的结合力(表3，图4)。

表2 小柴胡汤度值前10位化学成分基本信息

表3 关键化合物与核心靶点分子对接

注：a，槲皮素-MAPK1；b，山奈酚-RELA；c，黄芩素-TP53；d，柚皮素-ESR1。

3 讨论

小柴胡汤为仲景名方，原方主治少阳病，具有良好的疏肝利胆之效，在临床中防治慢性肝病方面发挥了重要作用[12-13]。近年来运用小柴胡汤治疗乙型肝炎的临床研究[14-16]使用频繁。但目前针对小柴胡汤治疗乙型肝炎的网络药理学与分子层面的研究尚有欠缺。

为深入研究小柴胡汤治疗乙型肝炎的作用机制，本文应用网络药理学的方法，共筛选得到193个活性成分及247个作用靶点，通过构建活性成分-核心靶点相互作用网络可知槲皮素、山奈酚、汉黄芩素、柚皮素等化合物度值较大，对应多个靶点，是小柴胡汤治疗乙型肝炎的主要活性成分。其中槲皮素具有良好的抗炎、抗氧化、抗病毒及抗肝纤维化等作用。研究[17-18]发现，槲皮素能显著降低HBsAg和HBeAg水平，并可抑制人肝癌细胞株HBV抗原分泌和基因组复制，具有显著的抗HBV活性，接近拉米夫定(69%)。乙型肝炎是肝纤维化发生发展的主因之一，肝纤维化可进一步发展成肝硬化，并最终导致危害人类生命、不可逆转的肝细胞癌及肝功能衰竭[19]。槲皮素可通过其抗氧化活性和对NF-κB等信号通路的调节来抑制肝毒性化合物四氯化碳诱导的炎症反应，减弱肝星状细胞的活化并减少自噬，从而达到减少肝脏损伤和预防肝纤维化的目的[20]。由此可见，度值最高(degree：100)且来自小柴胡汤中多味中药(柴胡、甘草、大枣)的活性成分槲皮素在小柴胡汤发挥治疗乙型肝炎的作用机制过程中起着举足轻重的作用。经查阅相关文献发现，富含在柴胡和甘草中的山奈酚[21-23]、黄芩中的汉黄芩素[24-26]、甘草中的柚皮素[27-28]均已被证实具有抗HBV、抗炎、抗肝纤维化、护肝抗癌等作用，与本研究所得主要活性成分作用于乙型肝炎的结果一致。上述主要活性成分均为黄酮类化合物，它们除了具有抗炎、抗病毒等作用，在治疗乙型肝炎的过程中还发挥了抗肝纤维化、护肝抗癌等多种功效，这与中医强调的“未病先防”“既病防变”等理念不谋而合。

通过PPI网络拓扑分析后筛选得到RELA、MAPK1、TP53、ESR1等14个靶点，提示其可能是小柴胡汤治疗乙型肝炎的核心靶标。研究发现在HBV X蛋白(HBx)和HBV介导的肝癌发生的动物模型中，HBx可通过原癌基因RELA与活性DNA脱甲基作用诱导EpCAM表达，由细胞毒性T淋巴细胞分泌的HBx和TNFα激活的RELA在慢性乙型肝炎及其相关肝细胞癌的发病机制中具有重要作用[29]。有研究[30-31]指出在HBV相关肝癌中经常发现肿瘤蛋白p53(TP53)突变，证实HBV感染与肝癌中TP53基因之间表达状态相关的候选单核苷酸多态性和分子途径具有密切关系。HBV是一种性激素应答病毒[32]，核受体超家族成员雌激素受体ESR1基因多态性与HBV持续感染显著相关[33]。研究[34]表明，ESR1可以通过调节雌激素稳定在一定的水平来阻止肝纤维化，避免肝细胞炎症损伤，抑制肝细胞凋亡等。小柴胡汤可以作用于雌孕激素受体，充分发挥对肝脏的保护作用。MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14等属于MAPK家族,它们均参与细胞增长、分化、凋亡、免疫及炎症反应等重要生物过程，并在MAPK信号通路中起着举足轻重的作用，已知乙型肝炎及其相关肝细胞癌的发生发展与MAPK信号通路关系密切[35]。此外，这些靶点均对应多个活性成分,如ESR1对应柚皮素、芒柄花素等89个活性成分，MAPK14对应汉黄芩素、异鼠李素等51个活性成分，这说明小柴胡汤具有多成分、多靶点协同治疗肝炎的作用。

GO功能富集分析结果表明，小柴胡汤中的活性成分可能通过囊腔、膜筏等细胞组分参与氧化应激反应、对脂多糖的反应等生物学过程。这些结果提示小柴胡汤作用于多细胞组分产生不同生物学功能，从而发挥治疗乙型肝炎的作用。KEGG通路分析结果显示，小柴胡汤作用于乙型肝炎的靶点主要涉及乙型肝炎通路、PI3K-AKT信号通路等。其中乙型肝炎通路是本研究预测小柴胡汤治疗乙型肝炎的靶点中富集最多的通路之一，且该通路直接作用于乙型肝炎，在抗HBV感染及抗炎过程中发挥重要作用，进一步提示了本研究的准确性和可靠性。PI3K-AKT信号通路与细胞增殖、周期和凋亡有着密切联系[36-37]。研究[38]发现，几乎所有的病毒都会对PI3K-AKT信号通路进行调控，以调节病毒在感染早期的活力，实现对宿主细胞的感染及介导细胞转化等。在HBV引起的慢性感染性疾病中，HBx可通过激活PI3K-AKT信号通路磷酸化转录因子Bad，抑制caspase 3的活性，进而阻断TGFβ诱导的细胞凋亡[39-40]。此外，PI3K-AKT信号通路的活化同时也是肝细胞癌变的主因之一[41-42]。

根据图4中的分子对接结果显示，槲皮素与MAPK1上的残基氨基酸LYS-114、ASP-111、GLU-109、MET-108形成氢键作用，山奈酚与RELA上的残基氨基酸GLU-359、GLU-197形成氢键作用，汉芩黄素与TP53上的残基氨基酸THR-97形成氢键作用，柚皮素与ESR1上的残基氨基酸ARG-394、ALA-350、HIS-524形成氢键作用。以上主要活性成分与关键靶点经过分子对接后提示结合能均≤-7.0 kcal/mol，匹配能量较低，说明小分子与大分子结合的构象稳定，结合性好，展现出良好的结合力，进一步验证其可信度，对后续临床及实验研究方向具有重要参考价值。

综上所述，小柴胡汤可能通过槲皮素、山奈酚、汉黄芩素、柚皮素等主要活性成分作用于MAPK1、RELA、TP53、ESR1等关键靶点，通过囊腔、膜筏等细胞组分参与氧化应激反应、对脂多糖的反应等多种生物学过程，激活或抑制乙型肝炎、PI3K-AKT等主要信号通路，产生抗病毒、抑制炎症、调节免疫、抗肝纤维化、护肝抗癌等功效，从而发挥治疗乙型肝炎的作用。本文通过网络药理学结合分子对接的方法，阐释了小柴胡汤治疗乙型肝炎的主要有效成分、作用靶点、相关通路及协同作用的分子机制，有助于从新的角度挖掘小柴胡汤治疗乙型肝炎的潜在价值，为后续进一步生物实验研究与临床应用提供了一定的理论基础。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：蓝绍航负责课题设计，资料分析，撰写论文；李娜娜、陶然、廖南盛、蒙荫杰、何草参与收集数据，修改论文；唐秋媛、毛德文负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。

附录1～3见二维码