医疗废水中粪大肠菌群多管发酵法检测及改进探讨

朱安贤

（江西省吉安市吉州环境监测站，江西 吉安 343000）

一、概述

调研国内外检测方法可知，针对粪大肠菌群的检测方法包括有纸片快速法、多管发酵法、酶底物法以及滤膜法，各种检测方法所得到的粪大肠菌群的浓度结果有所差异，但整体来看均能反映出污水中粪大肠菌群的浓度状况，笔者通过对项目中收集的医疗废水采用多管发酵法进行粪大肠菌群的检测实践，并在此基础上提出了部分改进探讨，项目具有一定的参考价值。

二、样品和方法

（一）主要仪器

本文根据监测要求选用的仪器主要有恒温培养箱，其温度控制在37℃±0.5℃；常规用到的灭菌和培养相关设备；小型的实验冰箱，温度控制在2℃～5℃；天平：感量0.1g；振荡器；无菌吸管：1m L（具0.01m L 刻度）、10m L（具0.1m L 刻度）、微生物实验所用到的移液器和匹配型号的吸头；经过灭菌处理的锥形瓶，其容量约520m L；经过灭菌的培养皿，其直径90mm。

（二）样品和试验环境

根据要求，本试验环境需要处于环境洁净度不低于10000 级的无菌室，样品包括一瓶医疗废水，编号1；一瓶阳性对照水样，编号2，一瓶灭菌蒸馏水做空白对照，编号3。

（三）检测方法

本试验采用多管发酵法检测医疗废水中的粪大肠菌群，标准参考《医疗机构水污染物排放标准》（GB 18466-2005）中的附录A。

（四）试剂及培养基情况

试剂包括两种：革兰氏染色液和灭菌的生理盐水，浓度约0.9%；培养基包含四种物料，主要用含有乳糖的蛋白胨培养液、含有乳糖的胆盐培养液、微生物实验中的EC 培养液以及EMB 培养基。

三、检验过程

实验具有检验的步骤，通过检验后还需要进行实验结果证实。

（一）检验过程

在确定水样污染程度的基础上混合后来进行三个水样量接种，三个水样需要采集5 个水样管，针对未受到污染的水样采集约0.1m L、1m L 以及10m L。在针对相对污染严重水样接种量跟前个步骤一致，接种完之后进入稀释步骤，稀释比约为1:10:100，稀释后的水量需要尽量少于1m L，根据要求，需要取稀释比以此为1:10:100，稀释方法参考相关标准下盛入10m L 的灭菌水管中，然后均匀混合，经过监测后达到1:10:100 的比例。其他稀释比根据以上方法也需要进行相应的稀释，根据不同浓度的乳糖胆盐培养液，制作成不同培养液样品，针对前期稀释的样品后在进入初发酵试验。

发酵的温度需要控制44℃±0.5℃，时间控制在24h±2h。试验过程针对产酸产气的发酵管标记为试验阳性。通过试验结果为阳性后需要分开进行培养，将含有乳糖胆盐培养基伊红美兰平板进行接触划线，在这个阶段需要调整试验温度，控制在37℃±0.5℃，时长同上。接着根据观察菌落形态来进行革兰氏染色、镜检以及后期的证实，其特征的菌落包括有一种是深紫黑色具有金属光泽或者不带金属光泽的菌落；另外一种为淡紫红色菌落，中心颜色较深。

（二）证实方法

证实主要通过双料乳糖胆盐培养液进行证实，水样取10m L，双料乳糖胆盐培养液取5m L，除此之外还需要通过取无菌的生理盐水和1m L 样品进行混合然后注入单料乳糖胆盐培养液管，同样此类型样管需要取5 管，温度控制44℃±0.5℃，时长为一天，其他注意事项同检验过程。

四、结果

根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从大肠菌群MPN 表（参考《医疗机构水污染物排放标准》（GB 18466-2005）中的附录A）中查得MPN 指数，接种5 份10m L 水样，5 份1m L 水样，5 份0.1m L 水样时，查表1 求得MPN 指数，MPN 值再乘10，即为1L 水样中的粪大肠菌群。如果接种的水样不是10m L、1m L、0.1m L，而是较低的或较高的三个浓度的水样时，也可查表1 求得MPN 值，再经下式计算成每100m L 的MPN 值，计算方法如下：

表1 乳糖胆盐初发酵试验结果

具体试验结果如表1 所示。

发酵管会有产酸产气的现象，针对此种样品需要转接种在伊红美蓝琼脂平板上，温度控制在37℃±0.5℃，时长约一天。观察菌落形态，具体如表2 所示。

表2 分离培养情况

挑取可疑菌落革兰氏染色镜检，结果如表3 所示。

表3 革兰氏染色镜检

通过染色结果将具有革兰氏阴性无芽孢杆菌的染色镜与乳糖蛋白胨培养液互相混合接种，温度控制在44℃±0.5℃，时长为一天，如果出现产酸产气的现象，此浓度便为阳性粪大肠菌群（表4）。

表4 复发酵试验结果

根据以上试验结果，在查阅MPN 检索表并且计算后1L 水样中的粪大肠菌群结果如表5 所示，空白对照结果为阴性，未检出粪大肠菌群，结果与预选设计一致，所以此方法检出粪大肠菌群较为准确。

表5 粪大肠菌群检测结果

五、改进方法探讨

本文改进方法调研国内外研究成果，主要选取了EC 培养法、5 管法和10 管法以及蛋白胨培养法。EC 培养法的在前期不需要经过发酵处理，直接放于EC 培养液中，将温度保持在44.5℃，保持24h 后通过查表法计算结果；5 管法和10 管法试验前需要将样品稀释，稀释后的5 管水样分别包括有100、10、1、0.1 以及0.01m L,10 管法根据条件取得每种水样接种5 管，其他试验流程参照多管发酵法；蛋白胨培养法只需要将样品导入至乳糖蛋白胨培养液中进行培养，培养24h 再继续观察结果，采取以上改进方法进行检测后，检测结果均在多管发酵法置信范围内，检测结果为可接受，具体如表6、7 所示。

表6 改进法与多管发酵法监测结果一览表

表7 改进法与多管发酵法置信值符合程度

通过分析改进法与多管发酵法相关系数可知，各改进法与多管发酵法相关性较高，其中10 管法、EC 培养法相关系数均在0.89 以上，5 管法相关系数为0.74，蛋白胨培养法相关系数较低，仅为0.48，因此在具备各种实验检测方法的基础上蛋白胨培养法并非最优选择，通过10 管法和EC 培养法检测所得的粪大肠菌群才具备很大的参考价值。