肿瘤坏死因子α短期刺激促进骨髓间充质干细胞的成骨分化

侯立鹏，马丽芳，王瑞青

(1.西安市第九医院 口腔科，陕西 西安 710054； 2.军事口腔医学国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，陕西省口腔医学重点实验室，第四军医大学口腔医院 牙体牙髓病科，陕西 西安 710032； 3.第四军医大学 基础医学院，陕西 西安 710032)

骨缺损是骨外科临床上常见的难题，骨再生修复材料始终是骨科研究的热点之一[1]；“支架”“种子细胞”“细胞因子”是骨组织修复材料不可或缺的三要素[2]。种子细胞方面，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)是研究最多也是最成熟的细胞之一[3]，但其体内、外的成骨能力较低。因此，提高BMMSCs的成骨效率成为国内外研究的热点[4- 5]。

种子细胞的定向分化离不开微环境中的诱导因素，很多证据表明炎症在骨折早期修复中起着重要的作用[6- 7]。一种新的方法是直接调节炎症因子的活性来促进骨质的再生，炎症因子中研究最多的是肿瘤坏死因子α(TNF- α)[8]。有实验证实，大鼠骨折的24 h内存在表达多种炎症因子如TNF- α、白细胞介素(IL)- 6、和IL- 1β的一个短暂的爆发期，一直持续3 d后才开始衰退[9]。据报道，短时间暴露于TNF- α可增强肌源性基质细胞的碱性磷酸酶(ALP)的活性和矿化结节的形成[10]，增加牙根尖乳头细胞的矿化[11]，并促进脂肪干细胞的骨再生[12- 13]。

本实验拟选用不同浓度的TNF- α短期刺激BMMSCs来检测其体内体外促进成骨分化的能力。

1 材料与方法

1.1 材料

MTS细胞增殖检测试剂盒(Solarbio公司)，ALP活性检测试剂盒(Beyotime公司)，二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)，蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(康为世纪生物科技有限公司)，TNF- α(R&D公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMMSCs的原代培养 人BMMSCs的培养参考文献[14]中的方法。将分离所得的单个核细胞以1.6×105个·cm-2的密度接种于玻璃培养瓶中，加入DMEM- LG培养液，于37 ℃、5%CO2条件下培养；接种48 h后换液，去除非贴壁细胞，以后每3～4 d换液1次，待细胞扩增铺满整个培养瓶表面的80%时用0.25%胰酶- 0.02%EDTA液消化分离贴壁细胞，进行传代接种培养，并记为第1代(P1代)，继而传代至所需的代数P5进行后续实验。

1.2.2 细胞增殖试验 将培养的P5代细胞悬液以1×104个·孔-1种植于96孔板中，每孔100 μl，分为不加TNF- α的对照组和TNF- α 1、10、50 ng·ml-1组共4组，每组5个复孔，预培养24 h后弃去孔内液体，分别加入0、1、10、50 ng·ml-1浓度的TNF- α诱导液刺激的BMMSCs。3 d后PBS漂洗3遍，常规细胞培养基继续培养7 d，分别在1、4、7 d取出固定，7 d后统一加入20 μl MTS溶液并放置培养箱中孵育2～4 h，吸去孔内液体呈蓝色结晶，再加入100 μl DMSO，置于水平摇床10 min 充分溶解蓝色结晶，酶标仪490 nm波长处测吸光度(OD490 nm)值。参照MTS试剂盒说明书进行检测。

1.2.3 细胞迁移试验 将P5代细胞密度调整为3×104个·ml-1,吹打均匀后向小室内加入细胞悬液200 μl，小室下层分别加入0、1、10、50 ng·ml-1TNF- α溶液、500 μl不含10%胎牛血清(FBS)的培养液，细胞小室37 ℃、5%CO2培养24 h后取出，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗小室2遍，4%多聚甲醛溶液固定细胞20 min，结晶紫染液染色10 min，PBS冲洗2遍。用棉签将小室上层未穿过小室膜的细胞拭去，干燥后倒置于荧光显微镜下(放大倍数为200倍)观察细胞数目。

1.2.4 ALP活性检测 将P5代细胞以2×104个·孔-1种植于48孔板中，0、1、10、50 ng·ml-1TNF- α溶液分别刺激3 d后，加入成骨培养液(含100 ng·ml-1地塞米松、50 μg·ml-1维生素C 和10 mmol·L-1β甘油磷酸钠)继续培养2周，去除培养基，冰PBS洗3遍，裂解液裂解细胞，冰上放置30 min，之后4 ℃、1 200 r·min-1离心30 min，取上清采用ALP活性试剂盒按说明书步骤进行检测。

1.2.5 TNF- α水凝胶的制备 明胶- TNF- α复合水凝胶的制备过程参考文献[15- 17]的方法。取100 mg明胶粉末融入900 μl PBS中，70 ℃搅拌1 h，然后将溶液装入注射器中备用。

1.2.6 小鼠极限模型、微计算机断层扫描技术(micro- CT)三维模型的构建及HE染色 小鼠分成含有生理盐水水凝胶的对照组和分别含有1、50 ng TNF- α溶液的水凝胶实验组3组。将麻醉的大鼠头皮上打开约20 mm的切口，充分暴露头盖骨，掀开骨膜后用电钻沿着矢状缝合线钻开一块5 mm的骨头，明胶海绵及时止血。再将分别含有生理盐水及1、50 ng·ml-1TNF- α的水凝胶置于伤口处，8周后将大鼠处死，取下颅骨标本，至少保留缺损周围2 mm正常颅骨，沿矢状缝分离双侧标本，分别对每个标本进行micro- CT扫描、三维重建。micro- CT扫描结束后，所有标本用10%中性缓冲福尔马林溶液固定72 h，EDTA溶液脱钙，期间用大头针轻戳标本，至针头可轻松刺入标本中提示脱钙完成，脱钙时间4～6周，脱钙完成后60%乙醇4 h→70%乙醇4 h→80%乙醇4 h→正丁醇8 h脱水，完成后常规石蜡包埋，再以5 μm厚度连续切片，所得切片行HE染色，观察各组成骨情况。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 BMMSCs细胞增殖测定结果

在不同浓度的TNF- α溶液中接种BMMSCs，1、4、7 d 后进行OD值测量，从第1～第7天，实验组和对照组细胞含量均有所增加，且组间无明显差异，不同浓度的TNF- α对BMMSCs的增殖无影响，见图1。

图1 各组不同时间的OD490 nm值

2.2 BMMSCs细胞迁移实验结果

与对照组相比，各实验组细胞迁移能力增强，且TNF- α浓度越高，细胞迁移能力越强，50 ng·ml-1TNF- α组的趋化效果最好，见图2。

图2 不同浓度的TNF- α能促进BMMSCs的迁移 A、B、C、D依次为1、10、50 ng·ml-1 TNF- α组及对照组

2.3 ALP的活性检测

BMMSCs在不同组1周和2周的ALP活性变化情况如图3，显示各组在1周时ALP活性均较低，组间差异无统计学意义(P>0.05)，在2周时1、10、50 ng·ml-1TNF- α均能显著促进BMMSCs的迁移(P<0.05)，且呈浓度依赖性递增，加入50 ng·ml-1TNF- α的成骨效果最好。

1、2、3、4依次为对照组及1、10、50 ng·ml-1 TNF- α组

2.4 micro- CT及HE染色

见图4、5。术后各组边缘至中央均有不同程度的新生骨长入，对照组则成骨速度较慢。HE染色结果显示各实验组和对照组缺损处均有新骨沉积，实验组的新骨形成显著多于对照组。实验组新骨沉积呈连续的整体形态，大部分骨缺损由致密的新骨填充，可见大量新形成的成熟骨组织，且50 g·ml-1TNF- α组的成骨效果最好。相比之下，对照组在缺损边缘显示出非常有限的新骨，呈不连续的岛状，缺损处的中心位置以纤维结缔组织为主。

○中为1 ng·ml-1 TNF- α组； □中为50 ng·ml-1 TNF- α组； ▽中为对照组

3 讨 论

本实验通过不同浓度的TNF- α作用于BMMSCs，检测TNF- α对BMMSCs生物活性的影响。

细胞增殖活性是活细胞的重要生理功能之一。MTS比色法是常用的检测细胞数量变化的方法，测定吸光度可间接反映活细胞数量，从而反映出活细胞的代谢水平。本实验加入不同浓度TNF- α溶液的BMMSCs增殖活性无明显差异。小室迁移实验反映细胞迁移的快慢及趋化能力的强弱。骨缺损的再生有赖于成骨细胞的迁移。显微镜下观察实验组细胞数明显较对照组增多，且加入1 ng·ml-1与10 ng·ml-1TNF- α溶液的细胞迁移数量相差不明显，而加入50 ng·ml-1TNF- α溶液的细胞数目明显增多，说明随TNF- α溶液浓度的增加迁移加快。ALP是反映成骨活性的重要指标，ALP活性能比较客观地反映成骨细胞分化成熟的程度[18]。本研究结果显示，各组在7 d时ALP活性均较低，组间差异无统计学意义(P>0.05)，在成骨诱导14 d 时，实验组ALP活性较对照组显著提高(P<0.05)，说明成骨分化一直在持续进行，该结果也提示TNF- α能够促进成骨分化，且含有50 ng·ml-1TNF- α的活性最高。

干细胞向成骨分化过程中炎症因子TNF- α起着重要的作用，其抑制或促进干细胞向成骨分化[19- 21]。

图5 HE染色观察骨形成情况 A.1 ng·ml-1 TNF- α组； B.50 ng·ml-1 TNF- α组； C.对照组

大量实验证明，TNF- α对干细胞的作用时间是决定其促进或抑制成骨的主要因素之一，同时TNF- α抑制或促进干细胞向成骨分化的过程与多条信号通路有关。长时间(4周)的TNF- α刺激可呈剂量依赖性抑制成骨，抑制核因子(NF)- κB信号可逆转这种效果，提示长期TNF- α刺激可能是通过NF- κB信号通路抑制成骨；而短时间(48 h)的TNF- α刺激可以通过MAPK信号通路下的JNK信号通路促进成骨[22]。这些均说明TNF- α短期作用可促进成骨分化而长期作用可抑制成骨分化，我们的实验结果与之一致。

水凝胶是一种含有大量水分的三维大分子网络，与天然细胞外基质(ECM)有着惊人的相似性[23]。凝胶化过程，从液态到固态的转变，可以通过一种微创注射的方式来实现。这种特性使得可注射水凝胶可用于组织工程，它们可以填充靶组织缺损并与之无缝结合[23- 30]。这种具有层次结构的水凝胶实现药物的缓释和控释在体外支持细胞增殖和成骨，在体内促进新生血管和骨缺损再生[31]。

体内与体外环境具有较大差异，本研究进一步将不同浓度(1、50 ng·ml-1)的TNF- α溶液包裹于水凝胶中置于大鼠颅骨缺损处观察其修复能力。三维micro- CT重建可对各组骨缺损愈合过程进行完整描述。实验组和对照组都是从缺损区域的外周向内进行骨生成；实验组成骨速度显著高于对照组，骨修复效果显著。为了验证micro- CT的分析结果，采用HE染色进行组织学观察，发现对照组和实验组缺损区域均有新骨沉积，实验组的新生骨量显著高于对照组，实验组新生骨更加均匀、成熟，成骨厚度较高，与micro- CT观察结果一致。

我们的实验证明TNF- α短时间刺激BMMSCs具有促进BMMSCs迁移、增殖及诱导其成骨分化作用。

TNF- α对干细胞向成骨分化起着双重作用，研究其具体机制对许多疾病的治疗有着重要意义。本实验通过TNF- α 3 d的短时间刺激促进了BMMSCs的成骨，这对深入研究炎症因子与膜内成骨之间的关系有重要参考价值，可为提高临床基于BMMSCs的骨缺损治疗效果提供理论基础及优化方案。