半枝莲碱对人骨肉瘤细胞增殖、侵袭与迁移的抑制作用及其机制

李国湘，方业汉，吴彬

(1.定安县人民医院 骨科，海南 定安 571200； 2.海南省人民医院 骨科，海南 海口 570311)

骨肉瘤是原发于骨的恶性肿瘤，好发部位为长骨末端。患者年龄多在25岁以下，而且男性患者比例高于女性[1]。肺是骨肉瘤转移最常见的部位，且肺转移后患者的生存率仅为30%左右[1]。目前的临床治疗措施中，除了对骨肉瘤进行手术直接切除外，化疗也是重要的治疗方式。临床常用的骨肉瘤化疗药物包括顺铂和甲氨蝶呤等[2]，但化疗药物常有骨髓功能抑制、神经损伤和肝肾损伤等各种毒副作用，且容易产生药物耐受，影响治疗效果[3- 6]。因此积极探索和开发新的安全高效的治疗药物成为骨肉瘤治疗的关键领域之一，而传统中药单体以其高效低毒的优势引起研究者的重视。半枝莲碱(scutebarbatine，SBT)是来源于中药半枝莲的二萜类生物碱，具有抗炎和抗菌等作用[7- 8]。此外，SBT也具有较强的抗肿瘤活性，对肺癌、白血病等多种肿瘤具有明显的抑制作用[9- 11]。但SBT对骨肉瘤是否也有抑制作用、其机制如何，目前缺乏相关研究。本研究将从细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭这4个方面入手，分析SBT对骨肉瘤细胞是否具有抑制作用，并对这种抑制作用可能的分子机制进行初步解析，以期为临床开发更加安全有效的治疗骨肉瘤的药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人骨肉瘤细胞株MG63、143B和Saos- 2购自ATCC(American Type Culture Collection)。所有细胞放置于含5%CO2的37 ℃培养箱中，用含10%胎牛血清(FBS，Hyclone公司)、100 U·ml-1青霉素和100 μg·ml-1链霉素的DMEM高糖培养基(Hyclone公司)培养，并进行常规传代。

1.2 主要试剂和材料

四甲基偶氮唑盐(MTT)、蛋白提取试剂盒、细胞裂解液(RIPA)、钠盐(BCA)蛋白定量试剂盒、十二烷基磺酸钠(SDS)购自重庆升博科技有限公司，结晶紫染液、牛血清白蛋白(BSA)和Horchest 33258染液购自北京索莱宝科技有限公司，Transwell小室、荧光素素酶底物、ECL显影液、PVDF膜和基质胶购自美国Sigma公司，蛋白质印迹法实验一抗B淋巴细胞瘤- 2基因相关启动子(BAD)、B淋巴细胞瘤- 2基因(BCL2)、活化的半胱氨酸蛋白酶3(cleaved caspase 3)、β- 连环蛋白(β- catenin)、原癌基因(C- myc)、G1/S- 特异性周期蛋白- D1(Cyclin D1)、糖原合成酶激酶- 3β(GSK3β)、磷酸化GSK3β(p- GSK3β)、GSK3β第9位丝氨酸(Ser9)和β- 肌动蛋白(β- actin)均购自美国Abcam公司，HRP标记的二抗购自北京博奥森生物技术有限公司，脂质体LipofectAMINE2000购自Invitrogen公司。本实验完成于延安大学医学院实验中心。

1.3 方法

1.3.1 MTT实验 143B细胞按照500个·孔-1的数量接种于96孔板，待细胞贴壁后用不同浓度(10、20、30、40、50 μmol·L-1)SBT处理24 h，加入5 mg·ml-1的MTT溶液20 μl，37 ℃孵箱孵育4 h，弃上清，加入DMSO(100 μl·孔-1)，室温避光振荡10 min，用酶标仪测定492 nm处各孔的吸光度(OD)值，并计算细胞生长率(=SBT组OD值/对照组OD值)。

1.3.2 克隆形成实验 143B细胞按500个·孔-1接种于6孔板，待细胞充分贴壁后用不同浓度(20、30、40 μmol·L-1)SBT处理，继续培养7 d，彻底弃去培养基，PBS洗两遍，4%多聚甲醛固定20 min，随后进行结晶紫染色，利用Image J软件计数克隆形成数目。

1.3.3 划痕实验 143B细胞接种于6孔板，培养至细胞融合度为95%，用200 μl枪头在细胞层上垂直划线，制造出宽度一致的划痕，用不同浓度(20、30、40 μmol·L-1)SBT处理，分别在划痕0和16 h后显微镜(40倍)下拍照记录，利用Image J软件测量划痕宽度并计算细胞迁移率[=(0 h划痕宽度-16 h后划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%]。

1.3.4 细胞侵袭迁移实验 将30 μl基质胶稀释液(DMEM培养基将基质胶原液按1∶5的比例稀释)均匀铺于小室，随后放置于37 ℃、5%CO2培养箱中，使其完全凝固。在小室内加入500 μl细胞悬液(6×104个·ml-1)，用不同浓度(20、30、40 μmol·L-1)SBT处理，小室放入24孔板培养48 h。用结晶紫对侵袭至小室下层的细胞进行染色，显微镜(100倍)下拍照记录，并计数统计侵袭细胞数。

1.3.5 蛋白质印迹实验 143B细胞接种在T75(底面积75 cm2)培养瓶中，当细胞融合度达70%时，用不同浓度(20、30、40 μmol·L-1)SBT处理143B细胞，继续培养48 h。提取总蛋白，经10% SDS- PAGE分离后，湿转法转移蛋白质到PVDF膜上，5% BSA封闭1 h，加入一抗，在4 ℃冰箱中孵育过夜，TBST 洗涤3次。加入HRP标记的二抗，37 ℃孵育1 h，滴加ECL显影液并在凝胶成像系统中采集蛋白条带图像。

1.3.6 荧光素酶报告基因实验 143B 细胞接种于T25(底面积为25 cm2)培养瓶中，当细胞融合度达60%时，进行TopLuc质粒(反映Wnt/β- catenin信号中TCF/LEF的转录活性)转染，体系如下：5 μl Lipofectamine2000+ 3 μg TopLuc质粒+200 μl DMEM培养液(无FBS无双抗)，4 h后再换成5 ml的完全DMEM培养基。继续培养细胞至融合度90%，胰酶消化细胞并接种于24孔板中，细胞贴壁后用不同浓度(20、30、40 μmol·L-1)SBT处理，继续培养6和12 h后，按照Promega荧光素酶检测试剂盒提供的操作方法检测荧光素酶活性的改变。

1.4 统计学处理

统计分析采用SPSS 22.0软件，数据作图采用Graph Pad Prism 5软件，实验数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 SBT抑制人骨肉瘤细胞株增殖

MTT实验显示：SBT可抑制人骨肉瘤癌细胞株MG63、143B和Saos- 2增殖，使细胞生长速度减慢，且呈一定浓度依赖性(图1)。在后续实验中选择20、30、40 μmol·L-13个浓度的SBT进行分析。克隆形成实验显示：SBT可抑制143B细胞的克隆形成(图2A)，使细胞克隆形成数减少(图2B)。以上结果提示，SBT可抑制骨肉瘤细胞的增殖。

a P<0.05； b P<0.01

图2 SBT对143B细胞克隆形成的影响 A. SBT对143B细胞克隆形成的影响(结晶紫染色)； B. SBT对143B细胞克隆形成的影响(克隆形成数，a P<0.01)

2.2 SBT促进143B细胞凋亡

Horchest 33258染色结果显示：SBT可诱导143B细胞凋亡，细胞核出现固缩、碎裂和染色质聚集等高亮荧光现象(图3A、B)。蛋白质印迹法检测结果显示：SBT处理后，促凋亡分子BAD蛋白水平增加，而凋亡抑制分子BCL2蛋白水平下降，细胞凋亡执行者caspase 3的活性形式cleaved caspase 3蛋白水平增加(图3C)。以上结果提示，SBT可促进143B细胞发生凋亡。

图3 SBT对143B细胞凋亡的影响 A. SBT对143B细胞凋亡的影响(Horchest 33258染色×100)； B. SBT对143B细胞凋亡的影响(凋亡率，a P<0.01)； C. SBT对143B细胞凋亡相关分子的影响(蛋白质印迹法)

2.3 SBT抑制143B细胞迁移和侵袭

划痕实验结果显示：SBT抑制143B细胞迁移，使划痕愈合延迟(图4A、B)。Transwell小室实验结果显示：SBT可抑制143B细胞的侵袭，使穿过小室的细胞数目减少(图4C、D)。以上结果提示，SBT可抑制143B细胞的迁移及侵袭。

图4 SBT对143B细胞迁移和侵袭的影响 A、B. SBT对143B细胞迁移的影响(划痕实验×40，a P<0.05，b P<0.01)； C、D. SBT 对143B细胞凋亡的影响(Transwell小室实验×100，c P<0.01)

2.4 SBT抑制143B细胞中Wnt/β- catenin信号途径的活化

为了验证SBT参与了骨肉瘤的生长和转移的抑制过程,我们利用荧光素酶报告基因实验和蛋白质印迹法分析了SBT对Wnt/β- catenin信号的影响。荧光素酶报告基因实验显示：SBT处理后，TopLuc荧光素酶活性降低(图5A、B)。进一步蛋白质印迹法分析证实：SBT处理后，β- catenin的蛋白水平下调，β- catenin所直接调控的下游分子C- myc及Cyclin D1的蛋白水平也相应降低(图5C)。不仅如此，SBT还可抑制Ser9的磷酸化水平(图5C)。以上结果提示，SBT可抑制骨肉瘤细胞Wnt/β- catenin信号活化。

图5 SBT对143B细胞中Wnt/β- catenin信号的影响 A、B. SBT 对143B细胞中Wnt/β- catenin信号的影响(荧光素酶报告基因实验，a P<0.01)；C.SBT处理36 h对143B细胞中Wnt/β- catenin信号的影响

3 讨 论

骨肉瘤是骨骼系统常见的恶性肿瘤，其临床常用的化疗药物毒副作用较大、易产生耐药性，因此开发新的治疗药物有助于提高骨肉瘤的治疗效果。SBT是从半枝莲中提取的生物碱单体，具有明显的抗肿瘤作用：SBT在体外和小鼠体内对肺癌细胞A549均具有明显抑制作用[9]；SBT也可抑制白血病细胞K562增殖(IC50为42.73 μmol·L-1)[10]。

本研究分析了SBT对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。MTT实验和克隆形成实验提示SBT可抑制骨肉瘤细胞增殖，划痕实验和细胞侵袭迁移实验表明SBT可抑制骨肉瘤细胞侵袭。caspase 3是凋亡的重要执行者，而cleaved caspase 3则是其活性形式[12]。BAD是经典的促凋亡蛋白，而BCL2则为关键的抗凋亡蛋白[13]。当细胞发生凋亡时，往往可检测到cleaved caspase 3、BAD和 BCL2的变化，并由此作为细胞发生凋亡的特征性标志。我们通过蛋白质印迹法分析发现，SBT可增加cleaved caspase 3和BAD的蛋白水平，降低BCL2蛋白水平，而Horchest 33258染色分析发现骨肉瘤细胞核出现核碎裂、核固缩等凋亡的细胞核形态表现，表明SBT可促进骨肉瘤细胞发生凋亡。上述结果提示，SBT对人骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭均具有较好的抑制作用，而对骨肉瘤细胞的凋亡则具有一定的促进作用。

在骨肉瘤中常有Wnt/β- catenin 信号的持续激活[14- 15]。利用药物抑制Wnt/β- catenin信号途径[16- 17]，或小干扰RNA靶向抑制β- catenin表达[18]，均可相应促进骨肉瘤细胞的凋亡。基于此，在机制研究中我们着眼于分析SBT对Wnt/β- catenin 信号的影响。首先荧光素酶报告基因显示SBT可抑制Topluc荧光素酶活性，初步提示SBT可抑制Wnt/β- catenin 信号。蛋白质印迹法分析发现SBT可使骨肉瘤细胞Wnt/β- catenin信号中关键分子β- catenin蛋白减少，继而使得β- catenin下游靶分子c- Myc和Cyclin D1蛋白水平降低。GSK3β是β- catenin的负向调控因子，当Ser9磷酸化后，GSK3β降解β- catenin的活性降低[19]，而我们通过蛋白质印迹法检测发现SBT可抑制GSK3β的Ser9磷酸化，由此推测：SBT可通过抑制GSK3β的Ser9磷酸化，继而促进GSK3β对β- catenin的降解，使得β- catenin水平降低，最终导致Wnt/β- catenin信号受到抑制。上述结果提示：SBT可能通过抑制骨肉瘤细胞Wnt/β- catenin信号途径抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并促进其发生凋亡。

本研究初步证实SBT可抑制人骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭而促进其凋亡。这可能与SBT抑制GSK3β的Ser9磷酸化，增强β- catenin负向调控分子GSK3β的活性，从而降低β- catenin蛋白水平，使得Wnt/β- catenin信号受到抑制有关。后续实验将继续探讨SBT对骨肉瘤细胞中其他信号途径如TGFβ、Hedgehog、p53、Cox2、JAK- STAT、NF- κB、MAPK和PI3K/AKT信号途径等肿瘤相关信号途径的影响，为深入阐明SBT抑制骨肉瘤的分子机制从而用于骨肉瘤的治疗奠定基础。