辣椒素激活TRPV1/钙蛋白酶- 1通路改善血管再狭窄的研究

郑波，王建，黄可，陈钊，罗小兰，罗晓静

(雅安市人民医院 神经内科，四川 雅安 625000)

支架介入治疗是目前治疗血管狭窄最常用的方法，但冠状动脉、颈动脉和外周动脉经皮介入治疗术后再狭窄比例非常高[1]，这严重影响了介入治疗患者的预后。有研究表明，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖及迁移是再狭窄的主要原因[2]，但目前尚无有效药物可遏制再狭窄过程中VSMCs的增殖及迁移，因此仍需深入研究相关机制。辣椒素(capsaicin)是从辣椒属茄科植物中提取的天然香草素类胡萝卜素[3- 5]，既往发现它在心脏肥大、动脉粥样硬化、高血压等多种心脑血管疾病中均发挥保护作用[6]，其天然受体瞬时受体电位香草素受体1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)是一种优先选择Ca2+的阳离子通道，可调节炎症因子钙蛋白酶，而钙蛋白酶亚型1(钙蛋白酶- 1)是诱导再狭窄过程的主要分子，但辣椒素是否通过此途径调节血管平滑肌细胞的增殖和迁移尚无报道。本研究初步探索辣椒素对血管再狭窄的可能作用及其机制，旨在为血管再狭窄的防治提供新的治疗靶点及理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

SPF级雄性C57BL6/J野生型(WT)小鼠40只，6～8周龄，体重(23.51±2.00)g，健康状况良好，由成都达硕实验动物有限公司提供。辣椒素、10%胎牛血清、二氨基联苯胺(DAB)购自美国Sigma公司；DMEM培养基购自美国HyClone公司；兔抗小鼠抗α- 肌动蛋白单克隆抗体、兔抗小鼠PCNA一抗和二抗、兔抗小鼠钙蛋白酶- 1一抗和二抗购自美国Abcam公司；血小板源性生长因子(platelet- derived growth factor- BB, PDGF- BB)购自美国R&D公司；细胞计数试剂盒- 8(CCK- 8)购自中国江苏Beyotime公司；Boyden小室购自美国BD公司；蛋白质测定试剂购自美国加利福尼亚州Bio- Rad公司；GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物及分组 小鼠安置于温度和湿度控制适宜、12 h/12 h昼夜循环的房间内，投喂标准实验动物饲料，自由获取饮用水。适应性喂养后将20只小鼠随机分为空白组和辣椒素组各10只，颈动脉结扎后分别用标准饲料(空白组)或含0.01%辣椒素的饲料(辣椒素组)喂养14 d。为进一步探索辣椒素发挥作用的内在机制，另将20只辣椒素干预小鼠分为标准组和使用TRPV1抑制剂5′- 碘树脂毒素(iRTX)干预的抑制剂组。所有实验均按照国家卫生研究院实验动物使用指南进行，并经雅安市人民医院动物护理与使用委员会批准。

1.2.2 细胞培养及分组 从消化后的主动脉中分离小鼠VSMCs，将细胞在5%CO2、37 ℃的DMEM培养基中培养，培养基中含Hepes缓冲液、100 U·ml-1青霉素、 0.1 mg·ml-1链霉素、谷氨酰胺和10%胎牛血清。用抗α- 肌动蛋白单克隆抗体(1∶80)对VSMCs进行免疫染色。在血清饥饿24 h后使用融合的第2代或第3代细胞进行所有实验。将VSMCs分为空白对照组和使用PDGF- BB预处理的生长因子组，再分组分别加入生理盐水、辣椒素(1 mmol·L-1)培养24 h，即形成标准对照组、辣椒素对照组、生长因子组和生长因子辣椒素组4组。

1.2.3 诱导颈动脉再狭窄 用40 mg·kg-1戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，经颈正中切口解剖出左颈动脉，用6- 0丝线结扎左颈动脉分支处的近心端，而右颈动脉作为内部对照[7]。分别在0、1、2、3和4周时麻醉和处死各组小鼠以获取其颈动脉。

1.2.4 VSMCs增殖测定 将PDGF- BB溶解在0.05%二甲基亚砜冻存液中，并在无血清DMEM中进一步稀释，用CCK- 8测定评估PDGF- BB对VSMCs增殖的影响。简而言之，在存在或不存在PDGF- BB(10 ng·ml-1)的情况下，将VSMCs接种于96孔板(每孔1×104个细胞)中培养24 h，然后向每个孔中加入0.2 mg·ml-1的CCK- 8试剂，并在37 ℃下孵育4 h，通过酶标仪测量450 nm处的吸光度值来评估细胞增殖。

1.2.5 细胞迁移分析 在细胞迁移分析中，使用24个涂有纤连蛋白的聚碳酸酯膜的改良Boyden小室(8 μm孔径)。简言之，在下层小室中用含或不含PDGF- BB(10 ng·ml-1)的无酚红DMEM填充。将涂有50 mg·ml-1纤连蛋白的滤膜固定在下层小室的顶部，使VSMCs(每孔1×105个细胞)迁移6 h，并用棉签从膜上侧除去未迁移的细胞。将膜下侧的细胞用4,6- 二氨基- 2- 苯吲哚染色，并在荧光显微镜下每个小室随机选择5个视野观察，所得数据表示每个视野的迁移细胞数。

1.2.6 免疫组化染色测定PCNA阳性细胞 在盐水灌注后，用4%多聚甲醛固定颈动脉并包埋在石蜡中，将薄切片(4～5 μm)用苏木精- 伊红(HE)染色，使用Image- Pro Plus软件测量颈动脉的内膜厚度和中膜厚度。石蜡切片使用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水；微波修复切片内组织抗原之后，均匀滴加0.3%双氧水，常温孵育10 min；滴加5%牛血清白蛋白封闭液，常温温育10 min；加PCNA一抗(1∶100)，4 ℃湿盒中孵育过夜，37 ℃复温1 h，再加二抗(1∶50)于37 ℃湿盒温孵30 min；滴加链霉素-过氧化物酶溶液(1∶150)，37 ℃下孵育30 min。每两步之间均使用PBS冲洗3次，每次3 min。滴加DAB染色溶液，37 ℃下孵育10 min，镜下(100倍)观察细胞质或细胞核呈棕色(结果中图片显示黑色)为阳性细胞，通过预设采样程序得到平均吸光度值和阳性面积，PCNA阳性细胞率=平均吸光度值×阳性面积所占百分比×100%。

1.2.7 蛋白质印迹法检测钙蛋白酶- 1的表达 在RIPA缓冲液中裂解颈动脉组织或VSMCs，用蛋白质测定试剂定量蛋白质浓度。取50 μg蛋白样品，电压80 V 开始电泳，当蛋白泳至分离胶、浓缩胶分界线时，将电压调至 120 V，待蛋白泳至凝胶底部时关闭电源、将凝胶上的蛋白转至PVDF膜，脱脂牛奶封闭1 h，再加一抗(钙蛋白酶- 1：1∶3 000；GAPDH：1∶3 000)4 ℃孵育慢摇过夜；TBST洗脱3次，每5 min 1次，加二抗(1∶5 000)，并以化学发光法显迹，采用凝胶图像分析系统对条带进行密度扫描，用Image J软件分析灰度值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 辣椒素减轻血管再狭窄程度

颈动脉结扎14 d后检测内膜厚度/中膜厚度(I/M)值。与空白组相比，辣椒素组的I/M值明显降低(P<0.01，图1A)。PCNA阳性细胞是细胞增殖的重要指标，结果显示，与空白组相比，辣椒素组的PCNA阳性细胞数明显降低(P<0.01，图1B)。上述结果表明，辣椒素减轻了小鼠血管再狭窄的病变程度。

2.2 辣椒素抑制PDGF- BB诱导的VSMCs增殖与迁移

为确定血管再狭窄的潜在机制，我们分离培养了小鼠原代VSMCs。4组细胞增殖和迁移的结果比较差异均有统计学意义(分别F=8.43和F=9.12，均P<0.01)。CCK- 8检测结果提示，PDGF- BB显著诱导了VSMCs的增殖(P<0.01，图2 A)，而辣椒素可显著抑制由此产生的VSMCs的增殖(P<0.01，图2A)。细胞迁移结果表明，PDGF- BB显著诱导了VSMCs的迁移(P<0.01，图2 B)，而辣椒素可显著抑制由此产生的VSMCs的迁移(P<0.01，图2 B)。上述结果表明，辣椒素可能通过抑制VSMCs增殖和迁移来预防血管再狭窄的发生。

a 与标准对照组比较，P<0.01； b 与生长因子组比较，P<0.01

2.3 辣椒素抑制VSMCs中钙蛋白酶- 1的表达及活性

4组VSMCs中钙蛋白酶- 1的表达及活性比较差异均有统计学意义(分别F=12.05和F=11.92，均P<0.01)。用蛋白质印迹法测定特异性光谱蛋白分解产物(SBDPs)的部分表达，表明钙蛋白酶- 1具有活性，且蛋白质印迹结果发现，与标准对照组相比，PDGF- BB可显著增加钙蛋白酶- 1的表达及活性(P<0.01，图3)。与生长因子组相比，生长因子辣椒素组细胞钙蛋白酶- 1的表达及活性显著降低(P<0.01，图3)。上述结果提示，辣椒素能够抑制VSMCs中钙蛋白酶- 1的表达及活性。

a 与标准对照组比较，P<0.01; b 与生长因子组比较，P<0.01

2.4 TRPV1抑制剂逆转辣椒素的抗血管再狭窄作用

经TRPV1抑制剂iRTX和辣椒素同时处理过的小鼠颈动脉I/M值和PCNA细胞数检测结果显示，抑制剂组的I/M值和PCNA阳性细胞数明显升高(P<0.01，图4A、B)。同时蛋白质印迹检测结果显示，与标准组相比，抑制剂组钙蛋白酶- 1的表达及活性明显增加(P<0.01，图4C、D、E)。上述结果表明，TRPV1抑制剂部分逆转了辣椒素的抗血管再狭窄作用，钙蛋白酶- 1可能是其关键介导分子。

a 与标准组比较，P<0.01

3 讨 论

血管狭窄疾病在心血管疾病中占比极高，支架介入后再狭窄限制了治疗的有效性，而VSMCs异常增殖和迁移形成新内膜被认为是再狭窄的主要原因[2，8- 10]。辣椒素已被证明在胃肠和心血管等多种疾病中有一定益处[11- 13]。基于此，本研究进一步探究辣椒素在血管再狭窄中的作用及其机制，以期为血管再狭窄的治疗和改善患者预后提供理论依据。

本研究发现辣椒素可降低结扎后颈动脉I/M值以及PCNA阳性细胞数，表明辣椒素可以改善血管再狭窄，提示辣椒素可作为其重要防治策略来深入研究[14]。与Zhang等[15]研究结果一致，本研究分离培养小鼠原代VSMCs，发现辣椒素显著抑制了PDGF- BB诱导的VSMCs增殖和迁移。TRPV1是辣椒素的天然受体，同样表达于VSMCs上，既往研究发现其介导VSMCs增殖和迁移，可加速血管损伤后的再内皮化，抑制新生内膜的形成[6，16- 18]。本研究进一步应用TRPV1抑制剂iRTX及辣椒素处理小鼠后，颈动脉I/M值及PCNA阳性细胞数均显著升高。这些结果表明，抑制TRPV1阻断了辣椒素的血管再狭窄保护作用，提示TRPV1直接参与了辣椒素的抗血管再狭窄作用。

此外，Ca2+和Na+离子可通过TRPV1流入细胞，从而触发一系列生物学效应，但此通道优先选择Ca2+离子[19- 20]。而钙蛋白酶作为一个钙依赖性的细胞内半胱氨酸蛋白酶家族，能调节细胞分化、迁移和凋亡等多个过程[21]。越来越多的证据表明，钙蛋白酶在血管再狭窄中发挥重要作用，且钙蛋白酶- 1是诱导再狭窄过程的主要分子。已有的研究发现，辣椒素的受体TRPV1可调节钙蛋白酶[22- 24]，但是该调节关系是否影响血管再狭窄发生尚未见报道。本研究发现，辣椒素干预后VSMCs中钙蛋白酶- 1的表达及活性均降低，提示钙蛋白酶- 1是辣椒素/TRPV1有效的下游调节靶点。

综上，辣椒素可通过TRPV1/钙蛋白酶- 1通路抑制VSMCs异常增殖和迁移，并降低小鼠颈动脉再狭窄后I/M值，改善血管再狭窄。该辣椒素抗血管再狭窄作用的研究，可为临床血管再狭窄的治疗提供新的思路和理论基础。