2019-2020年酒泉市市售羊肉多杀性巴氏杆菌污染情况调查及分析

夏冰芝

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)属革兰氏阴性菌，该病原可感染多种经济动物，其中包括猪、牛、羊和禽等，也可感染人，是重要的人兽共患性致病菌。不同动物感染该病所出现的临床症状差异较大，其中猪感染该病出现猪肺疫或萎缩性鼻炎、牛为败血症、禽为霍乱，而羊则表现为流行性肺炎[1]。多杀性巴氏杆菌属于机会致病菌，其主要寄生在宿主呼吸道和泌尿道粘膜，一般不会导致宿主发病，若外界环境导致宿主免疫力下降，多杀性巴氏杆菌则可导致其出现严重的临床症状。人感染巴氏杆菌病案例较少见，多由带病动物咬伤、抓伤或粘膜伤口接触病原污染物引起，可导致患者出现局部化脓，甚至脑膜炎等。

多杀性巴氏杆菌具有多个血清型，根据荚膜抗原差异可将其分为5个血清型，分别为A、B、D、E和F；根据脂多糖抗原差异则可将其分为16种血清型；此外，多杀性巴氏杆菌还可被分为产毒多杀性巴氏杆菌和非产毒多杀性巴氏杆菌[2]。甘肃省养羊业发达，近年来甘肃省部分地区羊群出现多杀性巴氏杆菌疫情，给当地养殖业造成巨大的经济损失[3]。多杀性巴氏杆菌在外界广泛存在，家畜在饲养、屠宰、运输和售卖等环节均易感染该病原，消费者食用被病原菌污染的肉类后可能导致食源性疾病，继而影响健康。随着人们对食源性疾病防控的重视，对市售肉类食源性病原污染情况调查的研究较多，但大部分研究是针对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等病原，对多杀性巴氏杆菌的研究相对较少[2，4]。

本文从酒泉市部分地区收集市售羊肉样品共257份，对样品中多杀性巴氏杆菌污染情况进行检测，同时对分离的菌株进行荚膜血清型鉴定及耐药性监测，旨在为该病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 于2019年3-9月和2020年5-9月从酒泉市部分地区(肃州区、金塔县、玉门市和敦煌市)农贸市场、屠宰场和超市采集新鲜市售羊肉样品257份，其中农贸市场、屠宰场和超市来源样品数量分别为93份、132份和32份。按照随机采样原则，每月中旬左右从各采样点采集样品，无菌采集样品后低温送至酒泉职业技术学院食品病原检测实验室进行检测。

1.1.2 主要试剂 本研究所需培养基均购自于北京陆桥技术有限公司；PCR反应及凝胶电泳等所需试剂均购自于宝生物工程(大连)有限公司；药敏纸片均购自于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离及鉴定 取1.0 g左右新鲜羊肉样品与适量生理盐水进行研磨，用灭菌接种环蘸取少量上清在含5%马血清的胰蛋白胨大豆琼脂培养基上进行划线，将培养基放在37 ℃恒温箱中培养24 h，挑取单一、疑似多杀性巴氏杆菌菌株进行革兰氏染色鉴定，并将其置于含5%马血清胰蛋白胨大豆肉汤培养基中进行增菌。

1.2.1.1 分离菌株16S rRNA基因分子鉴定 取少量扩增菌液煮沸，以上清为DNA模板，根据参考文献[5]合成鉴定多杀性巴氏杆菌16S rRNA基因引物 (表1)，以PCR法对本研究获得的菌株的16S rRNA基因序列进行扩增。PCR体系(25.0 μL)中包括PCR预混液12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、模板DNA样品2.0 μL和DPEC处理水8.5 μL。每个PCR反应均设置阳性和阴性对照，其模板分别为已知多杀性巴氏杆菌分离株核酸和去离子水。扩增条件为95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共36个循环；72 ℃ 5 min。PCR反应结束后取5.0 μL产物进行凝胶电泳，并观察结果。将阳性产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行双向测序，其后将测序结果拼接后在NCBI网络进行核苷酸序列BLAST比对。

1.2.1.2 分离菌株荚膜血清学型分子鉴定 根据参考文献[6]合成鉴定多杀性巴氏杆菌和荚膜血清学型的特异性引物 (表1)，通过PCR法鉴定分离菌株的荚膜血清型。PCR体系(25.0 μL)中包括PCR预混液12.5 μL、上下游引物各1.0 μL、模板DNA样品2.0 μL和DPEC处理水8.5 μL。扩增条件为95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共36个循环；72 ℃ 5 min。PCR反应结束后取5.0 μL产物进行凝胶电泳，并观察结果。

表1 多杀性巴氏杆菌16S rRNA基因及荚膜血清型鉴定引物序列及目的片段大小信息Tab.1 Information on primer sequences and target fragment sizes for capsular serotype identification of Pasteurella multocida

1.2.2 药敏试验 采用Kirby-Bauer法对本研究获得的菌株分别进行药敏试验。将菌液稀释至浓度为1.0×108cfu/mL，取100 μL稀释菌液均匀涂布在含5%马血清的胰蛋白胨大豆琼脂培养基表面，待表面菌液稍干后在每个培养基表面贴上4种不同的药敏纸片，做好标记后将培养基置于37 ℃恒温箱培养24 h，其后测定菌株对含有不同抗生素药敏纸片的抑菌圈。参考CLSI标准结合杭州滨和微生物试剂有限公司提供药敏判读标准[7]判定菌株对抗生素是否敏感、中介或耐药。

1.2.3 小鼠致病性试验 根据分子鉴定结果，从多杀性巴氏杆菌A型、B型和D型中分别选2个分离株进行小鼠致病性试验。将菌液浓度稀释为1×107cfu/mL。将42只6周龄雌性昆明小鼠随机分为7组(6个试验组和1个对照组)，每组6只。对试验组小鼠腹腔注射200 μL稀释菌液，对照组小鼠腹腔注射200 μL生理盐水。每日观察各组小鼠临床症状及死亡情况。

2 结 果

2.1 羊源多杀性巴氏杆菌细菌分离及鉴定 用灭菌接种环蘸取少量组织液在平板上进行细菌分离，24 h后发现部分样品培养基表面长有针尖状、(半)透明的菌落；将单一菌落进行革兰氏染色并镜检，结果发现有1种两端钝圆、中间稍微突起的短杆菌，且为革兰氏阴性菌，可将其初步鉴定为多杀性巴氏杆菌。为进一步对其进行分子鉴定，我们以PCR法对随机挑选的12份阳性样品(多杀性巴氏杆菌分离株)基因组中16S rRNA基因序列进行扩增与测序分，结果发现，12个分离株16S rRNA基因片段扩增产物大小为1 502～1 509 bp，进一步同源性分析发现以上分离株均为多杀性巴氏杆菌。

2.2 酒泉市部分地区市售羊肉多杀性巴氏杆菌污染情况调查结果 通过对257份市售羊肉样品进行细菌分离与鉴定，发现样品中多杀性巴氏杆菌检出率为6.22%(16/257)。进一步统计结果如表2，被调查的4个地区中以金塔县来源样品多杀性巴氏杆菌检出率最高，为9.3%(4/43)，其次为肃州区(7.62%)，而玉门市和敦煌市相对较低，分别为3.45%(2/58)和4.62%(3/65)；2019年采集的羊肉样品多杀性巴氏杆菌检出率较2020年高出近1.5倍，分别为9.17%(11/120)和3.65%(5/137)；此外，农贸市场/超市和屠宰场来源样品中病原检出率存在差异，分别为8.49%(9/93)、4.55%(6/132)和3.13%(1/32)。以上调查结果表明，酒泉市市售羊肉样品中存在多杀性巴氏杆菌污染情况，这无疑对消费者健康造成较大的威胁。

表2 酒泉市部分地区市售羊肉多杀性巴氏杆菌污染情况调查结果Tab.2 Investigation results of Pasteurella multocida contamination in mutton sold in several areas of Jiuquan City

2.3 多杀性巴氏杆菌血清型鉴定结果 以煮沸菌液上清DNA为模板，分别用多杀性巴氏杆菌荚膜血清型特异性引物以PCR法进行扩增，将PCR产物进行凝胶电泳。结果如表3，16个多杀性巴氏杆菌分离株中含有血清A、B和D型，未鉴定出E型和F型，对应菌株数量分别为9、5和2株，所占比例分别为56.25%、31.25%和12.50%。由此可见，该地区市售羊肉中多杀性巴氏杆菌血清型较为复杂，且A型为主要优势种。

表3 多杀性巴氏杆菌血清型鉴定结果Tab.3 Serotype identification results for Pasteurella multocida

2.4 多杀性巴氏杆菌分离株耐药性检测结果 对本文获得的16个多杀性巴氏杆菌分离株进行耐药性检测与统计。其结果如表4，分离株对14种常见抗生素耐药率为0%～100%，其中对林可霉素和磺胺甲氧嘧啶耐药率最高，分别为100%(16/16)和81.25%(13/16)；对氟苯尼考、氯霉素、头孢唑林和头孢他啶相对敏感，其耐药率分别为0.0%(0/16)、12.5%(2/16)、0.0%(0/16)和6.25%(1/16)。

表4 多杀性巴氏杆菌分离株耐药性检测结果Tab.4 Drug resistance test results for Pasteurella multocida isolates

2.5 不同血清型多杀性巴氏杆菌小鼠致病性试验结果 与对照组相比，部分试验组小鼠在接种对于菌株3 h后出现明显临床症状，主要表现为精神萎靡、不好动。血清型B多杀性巴氏杆菌-2(B-2)组小鼠在接种6 h后死亡1只，其后不同组部分小鼠均出现死亡现象，截至接种后30 h，A-1、A-2、B-1和B-2组小鼠全部死亡，而D-1和D-2组小鼠死亡率分别为50.0%和66.7%。对死亡小鼠进行解剖，发现小鼠心包周围有纤维性渗出，同时有肺出血，对血液样品进行涂片镜检，发现有类似多杀性巴氏杆菌形态学特征的菌株。以上结果说明，A-1、A-2、B-1和B-2分离株较D-1和D-2分离株对小鼠的致病性强。

3 讨 论

多杀性巴氏杆菌为重要人兽共患性病原，该病原感染人可导致病患出现发热、痉挛和出汗等症状，给患者健康造成一定威胁。人主要因动物咬伤而感染多杀性巴氏杆菌病，但食用被病原污染的肉类也具有感染风险。多杀性巴氏杆菌可感染多种宿主，且该病原在环境中广泛存在，而肉类在屠宰、运输和售卖过程中易受到病原污染，食用被该病原污染的肉类对消费者健康具有潜在威胁。已有报道表明我国市售肉类食源性细菌污染情况较为严重[2，4，7-9]，但针对市售肉类多杀性巴氏杆菌污染情况的调查较为少见。

羊肉因味道鲜美而受到广大消费者的喜爱，同时羊养殖业也是酒泉市农业发展的支柱性产业。本文旨在初步了解酒泉市市售羊肉多杀性巴氏杆菌污染情况，结果发现该地区被调查样品中巴氏杆菌检出率为6.22%(16/257)，其结果提示该地区市售羊肉中存在多杀性巴氏杆菌污染的情况，而该病原可通过伤口进入患者体内，故从事羊肉加工、运输和售卖的相关从业人员在工作时应注意自身防护。进一步统计结果发现2019年来源样品多杀性巴氏杆菌检测阳性率高于2020年，分别为9.17%和3.65%，笔者猜测由于新冠肺炎导致相关从业人员提高了对肉类的卫生管理水平，羊在饲养过程中感染多杀性巴氏杆菌的阳性率相对较低，可能其在屠宰、加工、运输和售卖过程会被该致病菌污染；且农贸市场来源样品较屠宰场、超市来源样品阳性率高出许多，这也进一步证实了我们的猜测，因为农贸市场来源的肉类在运输和售卖过程环境中致病菌更多，导致致病菌污染肉类概率也更大，这也提示在肉类运输和售卖过程中应注意卫生管理。

多杀性巴氏杆菌含有多个血清型，其中导致牛羊出现肺炎的多杀性巴氏杆菌主要为荚膜A血清型[10]，但其它血清型病原也可感染牛羊。刘海燕等研究中发现四川山羊多杀性巴氏杆菌荚膜血清型主要为A型和B型[7]，而王巍等首次在呼伦贝尔病羊中分离出荚膜血清型D型多杀性巴氏杆菌[11]。本研究以特异性PCR法对分离的菌株进行荚膜血清型鉴定，发现16个菌株中有9株为A型，5株为B型，2株为D型，但未检测到E和F型，提示该地区羊群流行的多杀性巴氏杆菌血清型较为复杂，这可能与肉类在运输和售卖过程环境污染有关。此外，进一步动物试验表明，随机挑选的血清型A型和B型多杀性巴氏杆菌较D型对小鼠的致病性更高，但其中原因还有待进一步研究。

目前对羊多杀性巴氏杆菌的防制主要依赖于抗生素的大量使用，但这也导致大量耐药株的出现。刘海燕等研究结果发现四川地区分离的羊多杀性巴氏杆菌对林可霉素和青霉素耐药率为100.0%，但其对氟苯尼考和复方新诺明等较为敏感[5]；井郁金等发现新疆地区绵羊源多杀性巴氏杆菌对头孢拉定、替米考星等敏感，但对林可霉素和阿米卡星高度耐药[11]。本研究结果发现酒泉地区羊源多杀性巴氏杆菌对氟苯尼考、氯霉素等抗生素高度敏感，但对林可霉素耐药率达100%，这与他人研究基本一致[5,11]，这同时也说明该地区羊源多杀性巴氏杆菌对不同抗生素耐药程度较高，应引起相关养殖户的重视。