狂犬病疫苗接种人群中狂犬病病毒中和抗体水平分析

张 磊，张 玲，张天喜，苏克文，谈思维，邵 吉，叶海朋，曹承建，黄春萍

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus, RABV)引起的一种人兽共患传染病，是目前世界上病死率最高的传染病，一旦发病，病死率几乎100%[1]。全世界99%的人间狂犬病发生在发展中国家，而我国狂犬病发病仅次于印度[2]。近些年，我国因狂犬病死亡人数一直高居传染病死亡数前3位，防控形势严峻[3-6]，而及时、规范的暴露后预防(post exposure prophylaxis，PEP)处置是预防狂犬病发生的唯一有效手段[7-8]，PEP内容包括：尽早伤口处理；尽早接种狂犬病疫苗；必要时，尽早使用狂犬病被动免疫制剂[9]。由此可见，注射人用狂犬病疫苗是暴露后处置的重要环节，通过人体主动免疫产生病毒中和抗体以达到清除和消灭病毒的目的。WHO认为免疫后血清中的RABV中和抗体≥0.5 IU/mL即达到有效保护水平[1]。为了解注射人用狂犬病疫苗后影响中和抗体水平的流行因素，本研究通过分析狂犬病疫苗接种人群中RABV中和抗体特征，以期为狂犬病防控提供参考。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2019-2020年杭州市职业病防治院犬伤后暴露预防接种门诊进行RABV中和抗体检测的就诊者信息，包括一般人口学基本信息、致伤动物、致伤部位、暴露等级、既往免疫史、疫苗品牌、接种程序、是否注射免疫球蛋白、是否全程接种、接种机构、末次接种日期、检测日期、检测结果等。研究对象入选标准如下：1)全程接种狂犬病疫苗者；2)接种前未注射免疫球蛋白者；3)末次接种疫苗后至检测中和抗体时间在半年以内者，最终纳入157例中和抗体检测者为研究对象。

1.2 方法 采用横断面研究方法对RABV中和抗体水平进行人群特征分析。全程接种狂犬病疫苗者根据其既往接种史，分为初种和复种，初种定义为除本次全程接种狂犬病疫苗外，既往无狂犬病疫苗接种史；复种定义为既往有狂犬病疫苗接种史，本次致伤距离末次接种时间超过3年而再次全程接种狂犬病疫苗者。根据《狂犬病预防控制技术指南(2016版)》[7]定义狂犬病暴露(以下简称暴露)：是指被狂犬、疑似狂犬或者不能确定是否患有狂犬病的宿主动物咬伤、抓伤、舔舐黏膜或者破损皮肤处，或者开放性伤口、黏膜直接接触可能含有RABV的唾液或者组织。RABV中和抗体检测采用快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT)：采集患者血样5 mL，3 000 r/min离心5 min，取待测血清56 ℃水浴30 min。96孔板每孔加入100 μL加入培养液。加入50 μL 80%细胞感染量stock-3，同时设置病毒对照和细胞对照，37 ℃中和1 h。加入10×106个/mL BSR细胞悬液50 μL，培养24 h，常规荧光抗体检测。实验所用BSR细胞株和狂犬病病毒标准攻击毒株(CVS-11)来源于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所狂犬病室，狂犬病病毒免疫球蛋白国际标准品购自欧洲药品质量管理局(批号：H1100000)。

1.3 统计分析 为使数据符合正态分布，将抗体效价作正态化处理，即对抗体效价进行常用对数转换。不同特征抗体水平比较分别采用两组比较的t检验和多组比较的方差分析。中和抗体水平随时间的变化趋势采用线性回归方程。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 全程接种狂犬病疫苗者中和抗体水平人群特征分析 研究对象中初种者98人，复种者59人，平均年龄(30.31±13.37)岁，最小2岁，最大73岁，其余特征见表1。不同人群特征中和抗体水平比较显示，复种者中2-1-1程序比5针法产生的抗体水平更高，其余特征在初种者与复种者中均无统计学差异(P>0.05)。研究对象中，仅1例初种者全程注射狂犬病疫苗后，中和抗体效价低于0.5 IU/mL，其余检测者中和抗体效价均高于0.5 IU/mL，该例情况如下：江苏籍3岁女童，于2020年4月7日被家养犬咬伤手臂，暴露等级Ⅱ级，致伤当日在安徽宿州某村卫生院采用5针法注射人用狂犬病疫苗，疫苗品牌不详，2020年5月6日完成第5针接种，于2020年5月20日前往杭州市职业病防治院进行RABV中和抗体检测，检测结果RABV中和抗体效价<0.5 IU/mL，该患者既往无狂犬病疫苗接种史。

表1 初种和复种狂犬病疫苗者中和抗体水平人群特征Tab.1 Crowd characteristics of rabies virus neutralizing antibody levels among primary and revaccination inoculators

图1 RABV中和抗体水平随时间变化趋势Fig.1 Time trends of rabies virus neutralizing antibody levels

其中，为中和抗体效价对数值的估计值，常数项1.567(t=26.962，P<0.001)，X为末次接种狂犬病疫苗后距离检测抗体的间隔天数，其标准化回归系数为-0.322(t=-2.230，P=0.031)。根据该回归方程可推算出末次接种疫苗后1年(即365 d)、2年(即730 d)及3年(即1 095 d)，RABV中和抗体效价95%个体区间分别为2.635～55.294 IU/mL、0.426～36.653 IU/mL和0.058～28.787 IU/mL。

3 讨 论

患者接种狂犬病疫苗后，其免疫效果如何，需要通过检测人体血清中RABV中和抗体来评价，而WHO仅推荐小鼠脑内中和试验(mouse neutralization test，MNT)和快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT)2种方法，作为RABV中和抗体的标准检测方法[10]。RFFIT因其不需要使用小鼠，且时间短(耗时2 d)等优点较MNT的应用更加广泛，该方法也是我国现行药典规定的检测RABV中和抗体标准方法之一[3]。但是由于RFFIT对实验室设备和人员要求比较高，目前国内开展RFFIT检测的机构较少[11-12]，而基于此法的RABV中和抗体相关流行因素研究更是鲜见。杭州市职业病防治院在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所狂犬病室的技术指导下，经过前期充分筹备，于2019年正式开展了RABV中和抗体RFFIT临床检测项目。本研究通过对2019-2020年该项目检测者的RABV中和抗体水平人群特征分析，以期对影响RABV中和抗体水平的流行因素进行探索，为狂犬病防控提供科学参考。

本研究采用RFFIT定量检测RABV中和抗体的基础上，获得狂犬病疫苗复种者采用2-1-1程序比5针法产生的抗体水平更高，提示2-1-1程序对人体再次免疫应答的效果优于5针法，这一结论与国内学者采用双抗夹心法和ELISA法定性检测RABV IgG抗体，观察到2-1-1免疫程序在接种7 d后RABV IgG抗体阳性率高于5针法的研究结论类似[13]。本研究还显示，在初种者中不同接种程序产生的中和抗体水平并无统计学差异，除此之外，不同性别、年龄、常住地、致伤动物、动物类别、暴露等级、致伤部位、疫苗品牌、接种机构等因素，均对初种者和复种者的RABV中和抗体水平不产生影响，与冯卢等[14]采用ELISA法定性检测RABV IgG抗体，比较抗体阳性率得到年龄和暴露部位对狂犬病疫苗接种后免疫效果产生影响的结论不一致，其原因可能为：1)两项研究检测的RABV抗体类型不同；2)研究效果指标不同，中和抗体效价为定量指标，IgG抗体阳性率为定性指标；3)样本量相差较大。关于上述因素对RABV中和抗体水平的影响，尚有待进一步积累更多样本后深入分析。

研究还发现，自末次接种疫苗后RABV中和抗体效价随时间延长呈下降趋势，估算出末次接种疫苗后2年，RABV中和抗体效价95%个体区间为0.426～36.653 IU/mL，下限值0.426 IU/mL 低于WHO提出的有效保护水平临界值0. 5 IU/mL[1]，提示接种疫苗2年后部分个体会出现失保护状态，鉴于狂犬病的病死率几乎100%，此时如果个体再次暴露有必要全程接种狂犬病疫苗，这一结论比我国现行《狂犬病暴露预防处置工作规范(2009版)》[15]要求的再次暴露后超过3年者应当全程接种疫苗的时限提前了1年。

感谢中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所狂犬病室的技术指导！