济南市腹泻患者沙门氏菌PFGE分子分型及耐药特征研究

李 娜，刘 辉，李 健，刘 铭，姜慧钰，陈 潇，关恒云，刘岚铮，张京云

沙门氏菌是能引起感染者腹泻的重要人兽共患病原菌之一，也是引起细菌性食物中毒的主要病原体之一，其分布广泛且血清型众多[1]，然而，不同血清型的沙门氏菌的致病性和对抗生素的敏感性不同，因而沙门氏菌的血清分型以及耐药分析对于临床治疗和研究具有重大意义[2]。脉冲场凝胶电泳(PFGE)是一种研究菌株同源性的有效方法，是国际公认的追踪溯源的金标准，对于细菌性传染病的监测及细菌性传染病疫情暴发的病原识别、追踪溯源有着非常重要的意义[3]。

近年来，由于抗生素的滥用导致了许多耐药细菌的产生，甚至出现了多重耐药细菌或者全耐药超级细菌，沙门氏菌作为重要的致病菌，其耐药性不容忽视[4-5]。本研究以济南市各哨点医院腹泻门诊患者中分离到的沙门氏菌为研究对象，进行PFGE分子分型和药敏试验，为控制沙门氏菌在济南地区的传播和进行临床治疗提供相关理论依据，同时为实验室监测、鉴定溯源及防控预警提供技术支持和数据参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株来源 本实验中90株沙门氏菌均分离自济南市哨点医院腹泻门诊患者的粪便标本。脉冲场凝胶电泳分子量标准菌株为沙门氏菌H9812，取自山东省疾病预防控制中心细菌所。药敏实验质控菌株ATCC25922购自中国工业微生物菌种保藏中心。

1.1.2 培养基和仪器试剂 沙门氏菌显色平板购自CHROMagar；营养琼脂，XLD琼脂均购自北京陆桥技术股份有限公司；沙门氏菌属诊断血清购自丹麦国家食品研究所；革兰氏阴性细菌鉴定卡、VITEK2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统以及比浊仪(bioMerieus Vitek colorimeter)均购自梅里埃生物有限公司；A3A4药敏板购自上海星佰生物科技有限公司；限制性内切酶XbaⅠ购自TaKaRa公司；蛋白酶K购自MERCK公司；Gelred购自Biotium公司；脉冲场凝胶电泳仪购自BIO-RID公司。

1.2 方 法

1.2.1 沙门氏菌的血清学分型 根据沙门氏菌血清型属White-Kauffmann Le Minor抗原表,利用玻片凝集法对90株沙门氏菌进行O抗原和H抗原血清凝集试验确定菌株的血清型别。

1.2.2 PFGE分子分型 参照美国疾病预防控制中心Pulse Net PFGE标准化方法进行[2]，将90株分离的沙门菌株用限制性内切酶XbaⅠ酶切后进行脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)，胶块经Gelred染液染色后成像，再将脉冲场电泳图谱导入BioNumerics软件进行聚类分析，构建聚类树，分析菌株间的相似性。

1.2.3 药物敏感试验 利用微量肉汤稀释法定量测定90株沙门氏菌对以下14种抗生素的药物敏感性：环丙沙星(CIP)、氨苄西林(AMP)、四环素(TET)、氯霉素(CHL)、复方新诺明(SXT)、头孢他啶(CAZ)、庆大霉素(GEN)、萘啶酸(NAL)、磺胺异噁唑(Sul)、头孢吡肟(FEP)、左氧氟沙星(LEV)、多西环素(DOX)、链霉素(STR)、亚胺培南(IMI)。根据美国临床实验室标准化委员会(CLSI)的相应标准获得相应敏感(S)、中度敏感(I)和耐药(R)的结果[2]。

2 结 果

2.1 沙门氏菌血清分型 对90株沙门氏菌进行血清学鉴定，共鉴定出27个血清型，主要为鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌，分别为43株和16株。

表1(续)血清型抗原式菌株数占比/%姆班达卡沙门氏菌6,7:z10:e,n,z1511.11斯坦利沙门氏菌4,5,12:d:1,211.11奥拉宁堡沙门氏菌6,7:m,t:-11.11雏生化沙门氏菌9,12:-:-11.11特西翁阔沙门氏菌6,8:e,h:e,n,z1511.11门登沙门氏菌6,7:z10:1,222.22科罗拉多沙门氏菌6,7:l,w:1,511.11金斯敦沙门氏菌4,12:g,s,t:-11.11丘古沙门氏菌6,7:z10:e,n,x11.11福尔斯布特尔沙门氏菌3,10:l,v:z611.11

2.2 脉冲场凝胶电泳及聚类分析 将90株分离的沙门菌株用限制性内切酶XbaⅠ酶切后进行脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)，胶块经Gelred染液染色后成像，90株沙门氏菌带型相似度在49%～100%(图1)。同一血清型沙门氏菌大部分菌株PFGE图谱可聚集成簇，但肠炎沙门氏菌与都柏林沙门氏菌PFGE图谱相似度较高，2种血清型菌株部分聚集成簇存在(图1)。

图1 90株沙门氏菌PFGE聚类分析图谱Fig.1 PFGE analysis of 90 Salmonella isolates

2.3 药敏试验结果 通过肉汤稀释法随机抽取40株沙门氏菌做药物敏感试验，结果显示其对氨苄西林耐药率最高，其次是萘啶酸、磺胺异噁唑、四环素、多西环素和链霉素，对头孢类抗生素较为敏感，对亚胺培南最敏感，敏感率为100%(表2)。

表2 40株沙门氏菌对14种抗生素的耐药情况Tab.2 Resistance of 40 Salmonella isolates to 14 antibiotics

40株沙门氏菌中只有8株对14种抗生素完全敏感，其余32株菌都有不同程度耐药(表3)。

表3 40株沙门氏菌耐药谱Tab.3 Drug-resistance spectrum of 40 strains of Salmonella

3 讨 论

感染性腹泻一直是重要的公共卫生问题，也是发展中国家常见的一种传染病[6-7]，每年约有6亿人发病，其中沙门氏菌是引起感染性性腹泻最常见的致病菌[7]，也是济南地区引起食物中毒的主要病原菌之一，沙门氏菌菌型繁多，迄今已发现2 500多个血清型[8]。本次研究中济南市共鉴定出27个血清型，主要优势血清型别为鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌，这与国际及国内其他研究结果一致[1-2,7,9-11]，特别是鼠伤寒沙门氏菌[12]，已成为济南地区最常见的血清型；不同的是济南地区的沙门氏菌血清型更复杂多样，且近年来频繁发生一些由罕见血清型引起的腹泻病例或者食物中毒事件[13]；且不同血清型沙门氏菌的致病性、临床表现以及流行病学特征值得我们进一步深入研究。

沙门菌污染食品致腹泻暴发由以前的点源性集中暴发，越来越多地转变为跨地区跨州(省)的散在暴发形式出现，使污染源及传播途径的发现存在一定难度[14]。目前，单纯的沙门氏菌血清分型鉴定已经满足不了复杂的食源性疾病诊断及对病原体进行溯源分析的需求，脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)是20世纪80年代中期发展起来一种非常有效的分子分型的方法，被誉为细菌分子生物学分型技术的“金标准”[15-17]。本研究中的PFGE分子分型结果显示，济南地区沙门氏菌带型多样具有多态性，以鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的带型最为集中，且无地域和时间的聚集性，说明近年来济南市无沙门氏菌既往暴发，但由于分离菌株数量较少，尚需不断扩大监测范围，不断建立并完善沙门氏菌PFGE分型数据库，为下一步为实验室监测、鉴定溯源及防控预警提供技术支持和数据参考。

近年来，由于抗生素的滥用导致了许多耐药细菌的产生[18]，甚至出现了多重耐药细菌或者全耐药超级细菌，从而使越来越多的患者对抗生素产生耐药[12,19-21]。感染患者的高病死率和缺乏有效抗感染药物的现状对临床治疗提出了挑战。本研究结果显示只有20%的菌株对14种抗生素完全敏感，其余80%的菌株都有不同程度的耐药，对氨苄西林耐药率高达72.55%，其次是萘啶酸、磺胺异噁唑、四环素、多西环素和链霉素，耐药率分别为65%、60%、55%、47.50%和55%。另外，沙门氏菌多重耐药现象非常明显，多重耐药率达67.50%，与聊城地区、上海地区及云南省等多地区多重耐药率相差不大[2,4,7,9,12,14]，但济南地区的多重耐药程度却是最严重的，从耐药谱来看40株菌共产生21个耐药谱，优势耐药谱为AMP+TET+NAL+Sul+DOX+STR，药物种类达到6种，相对其他省市来看，济南市耐药形式更为严重，其中耐4种及以上抗生素的有25株，占62.50%(表3)，约半数菌株对6种及以上抗生素产生耐药，2株鼠伤寒沙门氏菌和1株病牛沙门氏菌对9种抗生素产生耐药，还有1株印第安纳沙门氏菌对13种抗生素耐药，这是在国内沙门氏菌研究中非常罕见的，这些提示济南市沙门氏菌的耐药形势非常严峻，对耐药结果应进行深入的流行病学调查及分子生物学研究，以了解沙门氏菌菌株多重耐药原因，为解决沙门氏菌的耐药问题提供科学依据。

总之，本研究初步建立了济南市腹泻人群肠道沙门氏菌PFGE分子分型数据库，为今后的流行病学溯源及防控预警奠定了基础。与此同时，济南地区沙门氏菌的耐药现象不容忽视，且不同血清型的沙门氏菌耐药谱不同，临床应合理规范使用抗生素并加强耐药监测。另外，疾控部门、医院和食药监部门应加强合作，加大对食品的检测力度及并规范抗生素的合理使用，为食源性疾病的防治提供坚强后盾。