基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对分枝杆菌液体培养系统菌种鉴定的临床研究

杜岩青，秦中华，张丽霞

不同种分枝杆菌感染疾病的临床症状、影像学特征十分相似，但在致病性、药物敏感性、治疗方案上常截然不同，若无准确的病原学证据，可能造成误诊,因此快速、准确到种甚至亚种的病原学鉴定对于分枝杆菌的确诊及治疗具有重要意义。

当前国内外实验室主要采用液体、固体2种方法进行分枝杆菌的培养，固体培养既为传统的罗氏培养法耗时较长，需4～6周。液体培养系统使用的自动化培养系统如BactecTMMGITTM960(BD Diagnostics, Sparks,Maryland,USA)，1～3周即可检测到分枝杆菌的生长，较传统的固体培养更为敏感和快速，但无法区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，仍需进一步进行鉴定。

对于分枝杆菌的诊断，传统的生化鉴定方法操作复杂，影响因素多，耗时长，结果不准确，目前已不常使用，分子诊断技术的方法主要是比较同源基因或序列差异的方法[1]，由于方法复杂和成本高在临床上较难常规开展。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight massspectrometry，MALDI-TOF MS) 作为兴起的一种新的蛋白质组学检测技术，已广泛应用于临床常见细菌的鉴定，其鉴定原理是对微生物的核糖体蛋白组分析，从而形成不同的指纹图谱，区分微生物。核糖体蛋白提取的质量直接影响质谱鉴定结果，由于分枝杆菌细胞壁坚韧、脂质含量高，不易裂解获得足量蛋白质，因此标本需要前处理以获得足量的蛋白质，然而不同的前处理方法会影响到本方法的鉴别能力[2]。应用MALDI-TOF MS检测分枝杆菌鉴定国内外虽有相关研究报道，但前处理方法多局限固体培养培养[3-4]。现有的液体萃取方法并未获得高的鉴定率，且步骤繁杂，需要多次处理[5]。此外，由于样本以及液体介质的潜在干扰，阳性菌量数较低等因素，从液体培养基中准确的鉴定分枝杆菌还是较为困难[6]

本研究旨在通过摸索不同培养时间、处理方法寻找对BACTEC-960液体阳性培养物直接进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定的“最优处理方法”，并通过临床株进行验证，所有临床株同时做基因芯片法菌种鉴定做参照进行比对，结果不一致的通过基因测序验证，评价分枝杆菌液体培养后 MALDI-TOF MS直接鉴定的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究收集天津市海河医院2019年1月到2019年12月，MGIT 960分枝杆菌快速液体培养仪机器报阳的阳性培养物，其中420例作为研究对象。

1.2 试剂和仪器 甲酸、乙腈、基质和标准溶剂(美国Bruker Dahonies公司)，MALDI．TOF靶板和Autoflex MALDI．TOF质谱仪(美国Bruker Dahonies公司)，Flexcontrol 3．0软件和Biotyper 3．0软件(美国Bruker Dahonics公司),MALDI Sepsityper Kit(美国Bruker Dahonics公司)，超声震荡仪，0.5 mm氧化锆珠(美国BioSpec公司)，L-J 固体培养基(中国BASO 公司)，金属浴、质谱级纯水、无水乙醇，PCR扩增仪、芯片杂交仪和芯片洗干仪(博奥生物有限公司)，微型高速离心机(Eppendorf, 5424)，分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(博奥生物有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 确定最优前处理方法 选择临床上萋-尼氏染色阳性的痰标本15份，每份标本同时接种4支BD液体培基，进行BactecTMMGITTM960液体培养，4支样本分别于“报阳”时，孵育第1 d、第2 d、第3 d，由机器取出(或第1 d报告阳性后置于37 ℃温箱，到计划时间取出)，革兰染色确认有无杂菌进行质谱鉴定，具体操作如下：将BactecTMMGITTM960分枝杆菌快速液体培养系统报阳的标本，利用细菌超声分散计数仪将分枝杆菌菌分散均匀记录原管浊度，取1.2 mL培养液到1.5 mL Eppendorf管(孵育1、2、3 d的原管，同样操作)；离心2 min，转速13 000 r/min，用移液枪小心吸弃上清液；加入300 μL 去离子水，置100 ℃金属浴30 min；样本冷却后，加入900 μL 75%乙醇，充分混匀；离心2 min，转速13 000 r/min，用移液枪小心吸弃上清液；沉淀中加入约10 μL的0.1/0.5 mm 氧化锆珠，视沉淀多少加入15～30 μL的纯乙腈(没过沉淀)，漩涡震荡2 min或超声破碎2 min；加入与乙腈体积相同的70%甲酸溶液，涡旋震荡30 s；13 000 r/min 离心2 min，取上清1 μL 滴加到质谱仪靶板上，并在室温下自然晾干;在上述样品点上覆盖1 μL HCCA 基质溶液，自然晾干后即可上机质谱鉴定。

1.3.2 实验阶段 将420例研究样本通过预实验确定的“最优处理方法”后应用MALDI-TOF MS进行鉴定，同时应用DNA微阵列芯片法进行分枝杆菌菌种鉴定。2种鉴定结果不一致的样本，委托第三方实验室以基因测序的方法进行确认。基因测序委托天津金唯智生物科技有限公司检测。

2 结 果

2.1 最优前处理方法试验结果 对孵育不同时间的15例实验样本分别应用0.1 mm、0.5 mm氧化锆珠、漩涡震荡/超声破碎方式进行处理后，进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定结果如下：BactecTMMGITTM960系统报阳后，对培养物即刻进行MALDI-TOF-MS鉴定。BactecTMMGITTM960系统报阳后，对培养物继续孵育1 d、2 d、3 d后，15例标本全部鉴定出来，只是鉴定分值的不同，详见表1。不同处理方式对比结果，经孵育3 d，使用0.5 mm的氧化锆珠，超声震荡2 min处理后的平均鉴定分值最高，为“最优前处理方法”。

表1 不同前处理方法的MALDI-TOF-MS鉴定分数Tab.1 MALDI-TOF-MS identification scores of different pretreatment methods

2.2 临床标本鉴定出的分枝杆菌质谱结果及其质谱图 420例阳性标本分别为结核分枝杆菌复合群290例(69.05%)、偶发分枝杆菌10例(2.38%)、脓肿分枝杆菌28例(6.67%)、胞内分枝杆菌28例(6.67%)、堪萨斯分枝杆菌15例(3.57%)、戈登分枝杆菌4例(0.95%)、龟分枝杆菌6例(1.43%)、苏尔加分枝杆菌1例(0.24%)、浅黄分枝杆菌9例(2.14%)、马赛分枝杆菌2例(0.48%)、鸟分枝杆菌17例(4.05%)、摩纳哥分枝杆菌2例(0.48%)、免疫分枝杆菌1例(0.24%)、荷斯坦分枝杆菌1例(0.24%)、类戈登分枝杆菌1例(0.24%)、缓黄分枝杆菌1例(0.24%)，谱图举例见图1。

图1 MALDI-TOF-MS质谱分析图谱

2.3 MALDI-TOF MS和基因芯片的鉴定结果比对，见表2。

表2 MALDI-TOF MS和基因芯片的鉴定结果比对Tab.2 Comparison of identification results of MALDI-TOF MS and gene chip

2.4 MALDI-TOF MS与基因芯片鉴定成本和鉴定时间的比较 同时采用MALDI-TOF MS与基因芯片对病原菌进行鉴定，记录2种方法所需要的鉴定时间和鉴定成本，见表3。 MALDI-TOF MS的鉴定时间及鉴定成本均明显少于基因芯片。对临床而言，MALDI-TOF MS性价比更高。

表3 MALDI-TOF MS 和基因芯片鉴定成本和耗时比较Tab.3 Comparison of identification cost and time between MALDI-TOF MS and gene chip

3 讨 论

应用MALDI-TOF MS直接鉴定BactecTMMGITTM960液体培养出的阳性培养物，笔者认为主要有以下难点：①从液体培基中如何获得足以进行鉴定的菌量；②如何去除液体培基成分对菌体蛋白的影响；③如何高质量的获得菌体的核糖体蛋白。

BactecTMMGITTM960自动液体培养检测系统灵敏度设置的理念是尽可能快地检测分枝杆菌的生长，因此，系统报阳时液体样品含有较少的菌量[7]，本研究结果显示将液体培养的阳性培养物继续孵育至少1 d，菌量浓度≥0.5麦氏单位时，可获得可鉴定出的菌量。MGITTM960 液体培养基的主要成分是荧光指示剂(固定在管底)和培养液，培养液包括5.9 g/L改进的肉汤培养基和1.25 g/L的酪蛋白胨，如直接将报阳的液体培养基进行加热灭活，培养基中的蛋白质成分可能会干扰菌体蛋白的提取，因此我们通过将报阳的液体培基转移部分培养液至离心管，经过离心处理后取沉淀和质谱级纯水洗涤的方式来去除液体培基可能对菌体蛋白的影响。分枝杆菌细胞壁坚韧、脂质含量高，所以要想提取分枝杆菌的核糖体蛋白必须充分破坏其细胞壁，文献提供的方法一般是增加微型玻璃珠机械研磨及超声震荡等物理裂解法，以促进细胞壁坚韧的分枝杆菌属菌体裂解。但珠子直径大小，震荡时间方式文献各有不同，周昭彦等[8]通过对3种样本前处理方法的比较。发现直径0.1 mm氧化锆/硅胶珠机械震10 min此种前处理方法获得的质谱图质量高，优于0.1 mm珠子震荡3 min和0.5 mm珠子震荡1 min的方案，杨本善等[9]提供的方案是加入0.1 mm的氧化锆/硅胶珠，超声破碎2 min;本研究发现使用直径0.5 mm的氧化锆珠配合超声破碎2 min为最优的破壁方法所得结果最优，结论与上述2位研究者结论不同。

文献[10-12]显示质谱对分枝杆菌的鉴定效能差异较大，Cao Yan等[13]在2018年经过严格的筛选国外19篇涉及2 593株分枝杆菌分离物应用MALDI-TOF MS鉴定的准确性进行了系统回顾和荟萃分析，利用随机效应模型的森林图总结了属和种水平鉴定的荟萃分析的总体统计结果，临床分枝杆菌MALDI-TOFMS鉴定的属级准确率为85%，种级准确率为71%，该研究指出MALDI-TOF MS在临床致病分枝杆菌鉴定中的应用至今还不太令人满意，特别是在物种水平上，对改进的需求还是非常重要的。

国内也对质谱鉴定分枝杆菌的效能进行了评价，2016年杨本善等[9]自行设计的“同仁”分枝杆菌液体培养MALDI-TOF MS 直接鉴定法，可将分枝杆菌鉴定至种，准确率高达99.05%。2018年李松等[14]应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术对55株NTM的鉴定准确率进行评估，鉴定到属水平为89.1%，种水平为78.2%；2篇文献鉴定的准确率差异较大,质谱用于分枝杆菌鉴定的实验数据相当有限，临床实验室规模使用的前景还有待评价。本研究通过预实验确定的“最优处理方法”对临床株进行处理，得到了较好的鉴定结果，质谱鉴定420份阳性标本中鉴定出419例，其中结核分枝杆菌占69.05%(290/420)，非结核分枝杆菌占30.00%(126/420)，星型奴卡菌占0.48%(2/420)，巴西奴卡菌占0.24%(1/420)，1例未鉴定出，总鉴定率为99.76%。质谱鉴定分值≥2.0的400例占95.23%，分值在1.7～2.0的19例占4.52%，分值<1. 7的1例占0.24%。

基因芯片又称 DNA或cDNA 微阵列，根据载体探针与带标记的待测 DNA或 mRNA 杂交产生的信号强弱来判断靶DNA或mRNA中与芯片相应基因的变异或表达情况，已有分枝杆菌菌种鉴定的商品试剂盒上市，目前可以鉴定结核分枝杆菌和16种临床常见的NTM[15]。420份阳性标本，基因芯片法鉴定结果为结核分枝杆菌占69.05%(290/420)，非结核菌占28.81% (121/420)，9例未鉴定出，未鉴定占2.14%(9/420)，错误鉴定占0.95%(4/420)。

质谱和基因芯片鉴定不一致的菌株本研究采用基因测序予以确认。质谱鉴定分枝杆菌均全部正确鉴定至种(结核分枝杆菌鉴定至复合群水平)。2种方法鉴定不一致的菌株中，36例阳性培养物鉴定为龟-脓分枝杆菌复合群，质谱鉴定结果为28株脓肿分枝杆菌，6株龟分枝杆菌和2株马赛分枝杆菌，经基因测序与质谱鉴定结果一致。龟分枝杆菌和脓分枝杆菌被认为是在快生长分枝杆菌中人类最具致病性的菌[16],最初两者被认为是同一物种，直到1992年，分子生物学技术的发展才将其分离成2个不同的物种[17]。虽然龟和脓肿分枝杆菌几乎具有相同的生物化学特征，但两者在最佳生长温度、药物敏感性、致病性以及它们引起的感染类型、感控等方面存在很大差异。脓肿分枝杆菌的最佳生长温度为28 ℃～30 ℃，而龟分枝杆菌为35℃～37 ℃。在美国，脓肿分枝杆菌是引起MTN肺病的第3种常见病原菌，占快速生长NTM肺病的80%，此外还与皮肤创伤、术后软组织感染、中枢神经系统感染等有关[18]。相比之下，龟分枝杆菌仅仅是导致慢性肺病的少见原因，虽在囊性纤维化患者中较常见，但更广为人知的是引起角膜、皮肤和软组织感染的原因[19]。感控方面，普遍的共识认为NTM机会性感染具有环境源性，龟分枝杆菌人与人之间的传播还没有文献记载，但脓肿分枝杆菌有人与人传播的证据[20]。许多实验室只是简单地将分离株鉴定到龟脓肿复合群水平。这给患者带来了风险，因为复合群成员间的抗生素敏感性不同,比如脓肿分枝杆菌对头孢西丁敏感，而龟分枝杆菌则对头孢西丁耐药，克拉霉素均可用于治疗龟和脓分枝杆菌的感染，但脓肿分枝杆菌A型携带完整的erm基因，更易产生克拉霉素诱导耐药[21]，因此正确的将两者区分具有重要的临床意义。此外，基因芯片技术将马赛分枝杆菌鉴定为脓肿-龟复合群，马赛分枝杆菌属脓肿分枝杆菌复合群，但脓肿分枝杆菌亚种对阿奇霉素和克拉霉素的耐药性不同，其更易发生克拉霉素耐药，而马赛分枝杆菌对这2种药物的耐药性无差别，这就可以解释临床应用克拉霉素方案治疗脓肿分枝杆菌复合群的患者，疗效有异质性的现象[22]。不同物种甚至其亚种在致病性、药物敏感性、治疗反应性常常不同，因此快速、准确到种甚至亚种的病原学鉴定对于分枝杆菌的确诊及治疗具有重要意义。

此外成品的基因芯片商品试剂盒只能鉴定17种分枝杆菌，不在其范围内的分枝杆菌不能得到鉴定结果，因此对质谱技术检测出的摩纳哥分枝杆菌，免疫分枝杆菌，缓黄分枝杆菌等得出未鉴定或鉴定错误的结果，MALDI-TOF MS的分枝杆菌数据库可鉴定164个种的分枝杆菌，这也提示质谱仪对细菌的准确鉴定率与数据库的完善与否有很大关系，Couturier[23]的研究也提到仪器数据库中生物个体单一的参考光谱有时并不能代表分离自其他实验室的同种典型菌株。为提高MALDI-TOF MS对细菌鉴定能力准确性，我们要考虑菌株来源的地域差异性、标本来源的多样性和分离时间的不同。自建库时每一种菌种的特定图谱也应参考多个同种菌株以保证鉴定结果的准确性，并可通过自建库的方式扩大数据库。但MALDI-TOF MS的缺点主要表现为无法鉴定不能被培养的细菌；对混合性细菌的鉴定存在困难；本研究中有1例鉴定法分值低于1.500，系统提示可能为混合性细菌，因此分值较低。

质谱鉴定分枝杆菌的准确性多是与基因测序方法比对，自己设计引物或委托公司测定，均不是临床实验室常规应用的项目，而本研究用于比对的是多数临床实验室用于分枝杆菌鉴定的成品试剂盒，对质谱鉴定分枝杆菌的临床推广更有说服力。与基因芯片的鉴定方法相比，MALDI-TOF MS分析一个样品大约需要1 min，而整个样品完成鉴定只需要1～2 h。每个样品的检测费用约为5元。如果使用大量的测试样品，MALDI-TOF质谱鉴定分枝杆菌所需的样品量小、简单、快速、准确、廉价。综上所述，将MALDI-TOF-MS应用于临床微生物实验室进行分枝杆菌的常规鉴定是可行的，具有良好的应用前景。