低剂量CT薄层重建联用P16基因甲基化检测对肺小结节良恶性的诊断

田庆龙，章政，王全，宋长悦

1.黑龙江天元妇产医院影像科，黑龙江哈尔滨 150000；2.黑龙江省医院影像科，黑龙江哈尔滨 150000

近年来随着公众健康意识的提高，体检患者的数量逐年攀升，传统的X线平片在胸部检查时对于小结节的漏诊率较高，待临床症状出现，发现时多属于中晚期，患者的远期生存率差。低剂量螺旋CT（low dose ccomputed tomography，LDCT）的快速发展，凭借其辐射剂量低，分辨力高，对肺部疾病诊断敏感，一跃成为胸部体检的首选检查，低剂量CT扫描后薄层重建，对肺部小结节细微影像学特征显示较好，可以对肺小结节早期定性提供一定的诊断依据[1-2]。肺癌发生早期通常伴随一些基因的异常表达，其中P16基因的异常甲基化与其关系密切，检测P16基因的甲基化有助于肺小结节良恶性的早期鉴别[3-7]。该研究方便选取2018年2月—2019年10月间进行胸部检查患者1 115例，探究低剂量CT（LDCT）薄层重建联合外周血清P16基因甲基化检测，能否进一步提高肺小结节早起定性的准确率，从而达到早诊断早治疗的目的。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便选取进行肺部低剂量CT扫描的患者1 115例，纳入标准：患者身体健康，有能力自主完成屏气扫描过程，既往检查已知自身患有肺小结节（≤1 cm）。排除标准：有其他肿瘤病史或近一年内进行过CT扫描，有肺部手术史，近一月有发烧、感冒、咳嗽等呼吸道症状。将1 115例患者随机分为两组，一组557例（LDCT薄层重建-P16组），行低剂量螺旋CT扫描薄层重建联用外周血清P16基因甲基化检测；二组558例（LDCT组），仅采用普通低剂量螺旋CT扫描。LDCT薄层重建-P16组平均年龄（57±24）岁，LDCT组平均年龄（59±26）岁，两组间男女比例均约为1∶3。两组间数量、年龄、性别及健康状态差异无统计学意义（P＞0.05）。具有可比性。

该研究经过医学伦理委员会讨论审核通过，告知患者及家属相关内容及注意事项，并签署知情同意书。

1.2 方法

两组待检患者均采用德国西门子SOMATOM Scope 16排螺旋CT扫描，扫描体位：仰卧位，双臂上举过头顶，头先进，自主屏气后进行全肺扫描。电压设定为100 kV，电流50 mAs，层厚5 mm，螺距1.5。

1.3 图像重建

图像重建是采用SIEMENS公司研发出图像空间迭代重建算法 (iterative reconstruction in image space,IRIS)，IRIS是将原始数据进行空间迭代循环重建，这种算法生成的图像信噪比高，图像细节显示较清晰。LDCT薄层重建-P16组原始数据使用薄层重建，重建层厚设定为1 mm，肺窗（-600 HU,1 200 HU），纵隔窗（40 HU，400 HU）。LDCT组原始数据仅使用IRIS算法重建，窗技术条件如上。

1.4 图像分析

两组CT图像由两位放射科医师（主治及以上）独立完成阅片，并汇总可疑恶性征象，意见不同时，科室内其他医师一起会诊讨论，直至结果达成一致。观察内容包括肺结节的密度、毛刺、分叶、胸膜牵拉、小泡征，钙化（见表1），结节内没有钙化且满足前4种影像征象中的其中3种即为阳性病例。

表1 两组病灶影像学特征比较（n）

1.5 P16基因甲基化检测

LDCT薄层重建-P16组患者签署知情同意书，晨起无进食，近期无发热，无用药，采静脉血10 mL，低温离心，-70℃放置于恒温箱。按照QIAamp blood kit操作步骤提取血清DNA，然后进行硫酸氢盐修饰。取含DNA溶液50μl，加入4 mol/L NaOH,使样品浓度为0.2 mol/L，在37.5℃恒温水中保持10 min使其变性，再加入30μl的10 mmol/L的氢醌（现用现配）及pH值为5.0、浓度为3 mol/L的NaHSO3520μl，上层均匀涂薄层矿物油，暗室中将其放置在50℃的温水内16 h。应用Promega公司生产的DNA纯化试剂盒修饰DNA，常温23℃加入4 mol/L NaOH至浓度为0.3 mol/L，静置5～20 min，脱硫。最后加入17μl浓度10 mol/L醋酸铵及51μl的冰乙醇，在制冷箱内-20℃沉淀DNA后，室温下干燥，-20℃恒温保存待用。采用德国Biometra公司生产核酸扩增（PCR）仪,参照相关文献设计两组引物[3]，分别为P16基因甲基化引物，组成结构为5’-TTATTAGAGGGTGGGGCG2GATCGC和5’-GACCCCGACCGCGACCGTTA，片段长度为150 bp。P16基因非甲基化引物，组成结构为5’-TATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT和5’-CAACCCCAAACCACAAC-CATAA，长度片段为151 bp。反应液总体积50μl，经NaHSO3处理后的取样DNA约为50μg，各引物300μg。PCR缓冲液（16.6 mmol/L硫酸铵，67 mmol/L Tris-HCL，10 mmol/L 2-巯基乙醇，等。溶液pH值8.8）。首先，在95°C下添加引物10 min，添加2.0 U DNA polymerase（美国Promega），然后在95°C，60°C，72°C下循环40次，各温度30 s，最后在72°C延长5 min。然后将得到的PCR产物适当稀释（约为30倍），并将10μl用于下一次PCR扩增。退火温度设定为65℃，持续时间减少到15 s，其他顺序及条件与上次相同。待扩增完毕，取10μl PCR扩增产物，均匀涂于2.5%琼脂糖凝胶上的待检位置，甲基化的阳性对照选用经过甲基化处理的胎盘DNA，阴性对照选取正常外周血中的淋巴细胞DNA，空白对照用H2O。将待检各组涂抹完毕进行电泳分离，最后用溴化乙锭进行最终处理染色，进行比较分析。

1.6 P16基因甲基化判断

甲基化引物检测的电泳结果对比阳性对照与阴性对照，可疑恶性患者可以观察到在100～200 bp间扩增出特异性带，与阳性对照组位置相同，与阴性对照组位置不同，记录为甲基化阳性病例，空白对照组无任何特意带显示。

1.7 统计方法

采用SPSS 22.0统计学软件处理数据，计数资料以频数和百分率（%）表示，组间差异比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

LDCT薄层重建-P16组557例患者均完成低剂量扫描后薄层重建，551例完成血清P16基因甲基化检测，所以LDCT薄层重建和P16基因甲基化检测总完成率约98.92%，其中LDCT薄层重建得到阳性病例215例（约38.60%），P16基因甲基化检测阳性病例247例（约44.34%），最后得出两项同时阳性的病例182例，LDCT薄层重建-P16组阳性病例检出率约为32.68%。以上182例两项同时阳性患者，其中176例胸腔镜手术或穿刺进一步病理学检查，结果155例肺恶性肿瘤，腺癌居多共84例（见图1），鳞癌22例，腺鳞癌24例，小细胞癌25例。其他阳性患者后期3个月随访有13例结节明显增大或肺内结节增多，后胸腔镜手术或穿刺病理证实为肺恶性肿瘤，其中3例为转移瘤，其他患者目前仍在随访中，该组检查准确率约为92.31%。

图1 LDCT薄层重建-P16阳性病例图像

LDCT组全部完成低剂量CT扫描，经过影像科专家严格分析后最后得到可疑恶性52例，阳性检出率约为9.32%。52例阳性病例中46例进行手术或穿刺病理学检查；其中恶性肿瘤27例：腺癌15例，其他类型12例，准确率约为51.92%。该研究所有阴性患者均仍在定期随访，怀疑恶性的目标对象3个月随访。

LDCT薄层重建-P16组其灵敏度高达93.33%[（168/（168+12）]， 准 确 率92.31%均 高 于LDCT组（65.85%，51.92%），两组特异度96.22%[（357/（357+14）]与95.28%[485/（485+24）]，两组检出率差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

CT检查比普通胸片具有更高的分辨率[8]，且空间立体感强，为肺部小结节的早期发现提高了敏感性，但常规CT扫描辐射剂量较大，中国标准成人胸部CT辐射剂量诊断参考水平（DRL）为332 mGy·cm[9]，一次成人胸部常规CT检查有效辐射剂量约为3～27 mSv，是普通胸片的数十甚至上百倍[10]，对于CT检查所带来的辐射伤害患者通常心存忌惮，低剂量CT（LDCT）的快速发展完美解决了辐射剂量问题，该次检查的平均有效辐射剂量约为（1.12±0.27）mSv，相关研究低剂量CT胸部检查的辐射剂量可以降低至（0.82±0.24）mSv[11]，两者差异不大，均明显低于常规CT最低辐射剂量[10]，且可以满足临床诊断需要。每年低剂量CT体检一次，较采用常规胸片检查，肺癌病死率可降低约20%[12-13]。薄层重建技术更是将以往看不到的肺小结节特征清晰的呈现到诊断医师眼前，重建后的图像病变显示更细腻，分辨力更好[14-16]，对于肺小结节良恶性早期诊断有很大帮助。

经研究表明，肿瘤的形成常伴随某些基因的异常表达或者抑癌基因的失活，P16基因位于人类染色体的9q21区[17]，是人体内一种重要抑癌基因，它可以有效地抑制特异细胞增殖，具有延缓细胞周期的特殊制动作用，它通常作用于细胞分裂周期内的特定阶段，其关键区域CPG岛异常结构改变，常见如甲基化现象，会导致其正常功能丧失，当P16基因由于甲基化而失活后，可以引起PRB基因持续异常状态的磷酸化，此时不受抑制的特异细胞会急剧增多，最终导致肿瘤形成[18]，所以P16基因相关研究已经成为肺癌诊断研究热点之一。大量研究显示P16基因异常甲基化，很多身体的其他部位肿瘤或疾病也可以呈现阳性改变[19-21]，对肺小结节的定性诊断存在一定的假阳性,所以单独应用此项检测不足以达到定位定性的诊断目的。

肺小结节定义在直径＜1 cm，普通低剂量扫描层厚较大，对肺小结节细微的结构显示不清晰，通常仅用于肺小结节的筛查和定位，达不到临床定性诊断的要求。低剂量CT薄层重建1 mm观察肺小结节，可以很好地分析其影像学特征，对良恶性的判断可以提供一定的诊断依据，但对于较小的结节单纯依靠影像学检查，并不能提高恶性结节的诊断准确率，反而过早干预会造成一定的医患矛盾。

通过该研究现阶段病理反馈结果可以看出LDCT薄层重建联合外周血清P16基因甲基化检测对肺小结节良恶性诊断明显优于单纯的低剂量CT扫描，且手术后患者分期98%以上是I期，极大提高了患者的生存率，同时降低临床上对肺小结节的过度诊疗，作为一种无创、低辐射的检查手段，对肺小结节早期良恶性诊断有着极大的帮助。