新烟碱类杀虫剂对家蚕的急性毒性与风险评价
2021-11-03柳新菊吴声敢安雪花蒋金花王菲迪赵学平
柳新菊，吴声敢，安雪花，蒋金花，吕 露，李 岗，王菲迪，赵学平
(浙江省农业科学院 农产品质量安全和营养研究所，农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，浙江 杭州 310021)
蚕桑业是我国传统产业之一，现拥有世界丝绸70%的产业规模[1]。家蚕(Bombyxmori) 是一种具有很高经济价值的泌丝昆虫[2]。而家蚕在长期驯养过程中，由于人为提供适合其生长发育的环境条件，使其在经济性状得到充分表现的同时，抗逆性明显减弱，极易受到外界各种不良因素的影响[3]。桑叶是家蚕的唯一食料，桑叶受到污染后会对蚕桑业造成严重威胁[4]。在我国，由于农桑混植比较普遍，农田使用农药发生飘移以及桑园病虫害防治用药不当都可能会导致桑叶污染，从而引起家蚕农药中毒，影响其生长发育[5-6]。每年因农药残留造成的家蚕中毒事件可导致我国蚕茧产量损失在30%以上[7]。鉴于化学防治仍是当前国内外控制农作物病虫害的重要手段，农药在使用过程中不可避免地会对生态环境非靶标生物造成不利影响[8]。因此，开展农药对家蚕的毒性评价测试及其在蚕区周围环境使用的风险评估，对于确保养蚕生产安全和降低蚕业风险尤为重要[9]。
新烟碱类杀虫剂是目前世界上使用量最大的杀虫剂类别，该类药剂在使用初期被普遍认为对生态环境的危害较低[10]。然而随着该类药剂的大量广泛使用，其对生态环境和人类健康的不利影响逐渐表现出来[11]。国内外许多学者研究表明，新烟碱类杀虫剂的使用是引起欧洲和北美洲蜜蜂种群产生种群崩溃失调(colony collapse disorder，CCD)的重要因素[12-13]。尽管已有文献报道新烟碱类杀虫剂制剂对家蚕的急性毒性评价，但不同的农药厂家在加工新烟碱类杀虫剂制剂时使用的农药助剂可能不同，不能反映出该类药剂活性分子对家蚕的真正毒性效应[14-15]。因此，本研究以我国农业生产中使用量较大的传统农药有机磷类杀虫剂(毒死蜱与马拉硫磷)和拟除虫菊酯类杀虫剂(高效氯氟氰菊酯)为对照药剂，评价新烟碱类杀虫剂原药对家蚕的急性毒性，并进行初步风险评估，旨在为蚕区桑园及周围农田合理使用新烟碱类杀虫剂提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 供试生物
家蚕品种为菁松×皓月，蚕种由浙江省蚕种质量检验检疫站提供。用常规方法催青和饲养，恒温养虫室温度为(25±2)℃，相对湿度为70%～85%，光照黑暗比为16 h∶8 h。
1.2 测试药剂
1.2.1 新烟碱类杀虫剂
96%啶虫脒(acetamiprid)原药，江苏常隆化工有限公司；96.5%噻虫胺(clothianidin)原药，湖南比德生化科技有限公司；95%呋虫胺(dinotefuran)原药，江苏常隆化工有限公司；97%吡虫啉(imidacloprid)原药，南京红太阳集团有限责任公司； 97.5%噻虫啉(thiacloprid)原药，湖南比德生化科技有限公司；98%噻虫嗪(thiamethoxam)原药，上虞颖泰精细化工有限公司。
1.2.2 对照药剂
有机磷类杀虫剂：97%毒死蜱(chlorpyrifos)原药，江苏常隆化工有限公司；95%马拉硫磷(malathion)原药，江苏腾龙生物药业有限公司。拟除虫菊酯类杀虫剂：96.5%高效氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)原药，农业农村部农药检定所提供。
1.3 急性毒性测试方法
采用我国《化学农药环境安全评价试验准则》中推荐的浸叶法[16]。试验前，将供试原药用丙酮与吐温-80配制成一定浓度母液，进行预备试验初步确定正式试验的浓度范围。正式试验时将各种药剂用0.1%吐温-80分别稀释成5～7个系列浓度。试验时取整片桑叶浸没于不同浓度的试验溶液中(10±2)s，自然晾干后剪成长方形并转入直径9 cm 培养皿内。以清水浸渍桑叶为空白对照，以含丙酮与吐温-80的水溶液作为溶剂对照，试验组、溶剂对照组和空白对照组均设3个平行，每平行20头2龄起蚕。将处理后的试虫置于温度为(25±2) ℃、相对湿度为70%～85%植物培养箱内连续取食桑叶96 h，观察并记录 24、48、72、96 h供试家蚕的中毒症状及死亡情况。对照组死亡率<10%的试验为有效试验，且用镊子轻触虫体无反应视为死亡。根据药剂各浓度组设定浓度与对应的死亡率，采用“DPS数据处理系统”18.1高级版计算各种药剂对家蚕的毒性回归方程，半致死浓度(LC50)与95%置信限。
1.4 毒性等级划分依据
根据我国农药对家蚕的毒性等级划分标准[16]，将急性毒性分为4个等级: 当LC50≤0.5 mg·L-1时，农药对家蚕为剧毒，0.5 mg·L-1
1.5 初级风险评估
1.5.1 初级暴露分析计算方法
根据农药的使用方法和家蚕的暴露途径，选择飘移场景下对其进行风险评估。根据指南NY/T 2882.5—2016[17]要求，按公式(1)和公式(2)分别计算多次施药后最外围桑树上的预测暴露浓度(PECma-fr)和次外围桑树上的预测暴露浓度(PECma-sr)。
Vfr=VAR×R95×DPHI×MAF×Pfr；
(1)
Vsr=VAR×R95×DPHI×MAF×Psr。
(2)
式中：Vfr表示PECma-fr的值；Vsr表示PECma-sr的值；VAR表示单位面积农药最高使用剂量(AR，单位为kg·hm-2)的值；Pfr表示最外围一行桑树上的漂移因子；Psr表示次外围一行桑树上的漂移因子；R95表示类似桑树的作物第95百分位的单位残留量(单位为mg·kg-1桑叶)/(kg·hm-2)；DPHI表示桑叶上农药的降解系数，可根据公式DPHI=e-ln2×PHI/DT50计算；式中DT50表示农药在桑叶上的降解半衰期，单位为d，采用默认值10 d；PHI表示农药最后一次使用距离桑叶采收的间隔期，单位为d，采用默认值1 d。MAF为多次施药因子，可根据MAF=(1-e-n×i×ln2/DT50)/(1-e-i×ln2/DT50)计算；式中n表示施药次数，i表示施药间隔期，单位为d。
1.5.2 初级效应分析
按照公式(3)计算预测无效应浓度(CPNE)。
(3)
式中:VEnP表示急性毒性终点(EnP，单位为mg·kg-1桑叶)的值，EnP采用急性毒性试验的LC50，其单位为mg·L-1；FU为不确定因子。初级效应分析中选择不确定性因子为70。
1.5.3 风险表征
按照公式(4)计算风险商值(RQ)。
(4)
式中：VRQ为RQ的值；CPE表示预测暴露浓度(单位为mg·kg-1桑叶)；CPNE表示预测无效应浓度(单位为mg·kg-1桑叶)。当RQ≤1，风险可接受；当RQ>1，则风险不可接受。
2 结果与分析
2.1 测试药剂对家蚕的中毒症状
2 龄起蚕经过不同类别的杀虫剂添食处理后，中毒症状有很大差异，食下新烟碱类杀虫剂的家蚕幼虫多数出现拒食、胸部膨大、体色发黑、体缩，扭曲呈“C”或“S”形等中毒症状；而食下拟除虫菊酯类杀虫剂高效氯氟氰菊酯的家蚕幼虫出现拒食、吐液、身体扭曲、侧倒死亡等症状; 食下有机磷类杀虫剂毒死蜱和马拉硫磷的家蚕幼虫与食下新烟碱类杀虫剂的主要中毒症状相似，食下马拉硫磷的家蚕幼虫还出现吐液症状；6种新烟碱类杀虫剂引起家蚕幼虫的中毒症状基本相似，主要表现出拒食、身体呈“C”和“S”形扭曲的症状; 但个别药剂也有不同，如食下噻虫嗪和啶虫脒的家蚕幼虫均有吐液症状。测试药剂对家蚕的中毒症状如图1所示。空白对照未出现中毒症状。
2.2 测试药剂对家蚕的急性毒性
由表1可知，6种新烟碱类杀虫剂中，啶虫脒和噻虫胺对家蚕 2 龄幼虫 96 h-LC50分别为 0.262、0.268 mg·L-1，毒性都很高，但其毒性均低于拟除虫菊酯类杀虫剂高效氯氟氰菊酯(LC50为0.009 09 mg·L-1)；噻虫啉、吡虫啉、呋虫胺和噻虫嗪的LC50分别为 0.582、1.68、2.60、2.16 mg·L-1，与有机磷类杀虫剂毒死蜱的毒性相近，毒性也较高。马拉硫磷对家蚕 2 龄幼虫 96 h 的LC50为1 072 mg·L-1，则为低毒，空白对照未出现死亡现象。根据我国农药对家蚕的毒性等级划分标准，啶虫脒、噻虫胺和高效氯氟氰菊酯属于剧毒级，噻虫啉、吡虫啉、呋虫胺、噻虫嗪和毒死蜱均属于高毒级，马拉硫磷属于低毒级。9种农药对家蚕的急性毒性(96 h结果)次序为：高效氯氟氰菊酯>啶虫脒>噻虫胺>噻虫啉>毒死蜱>吡虫啉>噻虫嗪>呋虫胺>马拉硫磷。
表1 新烟碱类杀虫剂及其他3种杀虫剂对家蚕的急性毒性
2.3 风险评价
2.3.1 初级暴露分析
9种杀虫剂对家蚕暴露分析结果如表2所示，通过中国农药信息网农药登记信息数据库并结合参考文献，查询各农药在我国登记的田间最高喷雾施用剂量、施用次数和施药间隔，按最高风险原则收集数据；采用飘移场景多次施药的情况进行暴露分析，进而对初级风险进行定量描述。初级风险评估时R95采用默认值950 (mg·kg-1)/(kg·hm-2)，Pfr采用默认值9.8%，Psr采用默认值0.6%。
表2 不同杀虫剂对家蚕的暴露分析
2.3.2 初级效应分析和风险表征
9种杀虫剂对家蚕的初步效应分析和风险表征结果见表3和表4，根据指南NY/T 2882.5-2016[18]，采用家蚕的急性毒性(浸叶法)96 h-LC50为急性毒性终点。LC50单位为 mg·L-1，EnP采用急性毒性试验的LC50，单位为mg·kg-1桑叶，因单位不同，需按公式LC50-C=LC50×FC修正，其中LC50-C表示修正半致死浓度，单位为mg·kg-1桑叶；FC表示修正系数。得到修正半致死浓度LC50-C后，带入风险商公式(4) 计算求得RQ值。初级风险评估结果表明：在飘移场景下，最外围桑树的RQ值均大于1，次外围桑树的RQ值除马拉硫磷外均大于1，说明这9种杀虫剂在目前登记的田间最高施用剂量下以最外围桑树的桑叶饲喂家蚕，对家蚕的风险均不可接受。9种杀虫剂在以次外围桑树的桑叶饲喂家蚕，除马拉硫磷对家蚕的风险可接受外，其余均不可接受。9种农药对家蚕的风险次序为: 高效氯氟氰菊酯>毒死蜱>噻虫胺>啶虫脒>噻虫啉>吡虫啉>呋虫胺>噻虫嗪>马拉硫磷。
表3 不同杀虫剂对家蚕的初级效应分析
表4 不同杀虫剂对家蚕的初级风险评估
3 讨论
鉴于家蚕在我国农业生态系统和农业经济中的重要性，有关农药对家蚕的毒性测试方法和安全评价工作已有不少报道[19-20]。国内外学者评价家蚕的急性毒性主要包括浸叶法、药膜法、熏蒸法和口器注入等测试方法[5，8，18，21]。总体来看，浸叶法能全面反映农药对家蚕的胃毒、触杀和熏蒸毒性，与田间农药对家蚕的实际危害接近，且该方法操作简单和重复性好，可为风险评价提供可靠且科学的毒性终点[19]。因此，本研究采用浸叶法评价了新烟碱类杀虫剂对家蚕的急性毒性效应。
本研究结果表明，新烟碱类杀虫剂啶虫脒和噻虫胺对家蚕为剧毒级别，而其余的4种药剂为高毒级别。总体来看，测试的6种新烟碱类杀虫剂对家蚕表现出高毒—剧毒级别，这与崔新倩等[14]的报道基本一致，但本研究测试的啶虫脒对家蚕96 h-LC50显著低于其报道的2.73 (2.34～3.20) mg· L-1，而噻虫胺、噻虫啉、吡虫啉和噻虫嗪对家蚕96 h-LC50分别显著高于其报道的0.065 (0.051～0.083)、0.26 (0.22～0.30)、0.17 (0.15～0.21) 和1.31 (1.12～1.54) mg· L-1，这可能是由于本研究采用的是新烟碱类杀虫剂原药而文献报道采用的是新烟碱类杀虫剂相应的制剂。农药加工过程中使用的助剂可能影响杀虫剂的毒性，这可能是因为助剂本身有毒，也可能是因为助剂中的某些成分增加了杀虫有效成分向家蚕体壁的渗透，从而影响了农药整体毒性，还有可能是因为助剂中的某些成分改变了家蚕对于农药有效成分的代谢能力等[22]。此外，本研究的对照药剂毒死蜱对家蚕96 h-LC50显著低于崔新倩等[14]报道的1.51 (1.29～1.71) mg·L-1，而高效氯氟氰菊酯对家蚕96 h-LC50显著高于戴建忠等[23]报道的0.004 6 (0.003 7～0.005 2) mg·L-1，这也可能是由于本研究采用的是杀虫剂原药，而文献报道采用的是对应的制剂，制剂中的助剂影响了杀虫剂有效成分的毒性。但总体来看，对照药剂毒死蜱和高效氯氟氰菊酯原药和对应的制剂对家蚕的急性毒性级别分别是一致的。
已有研究表明，含硝基的新烟碱类杀虫剂(吡虫啉、噻虫胺、噻虫嗪、烯啶虫胺和呋虫胺)比含氰基的杀虫剂(啶虫脒和噻虫啉)对蜜蜂的毒性更大，其原因可能是含氰基新烟碱类杀虫剂可快速地被生物转化和代谢降解[24]。由于含有硝基的新烟碱类杀虫剂对蜜蜂具有极高的毒性效应，部分欧洲国家(法国)在2018年9月1日已经开始部分禁用新烟碱类杀虫剂，但在世界范围内新烟碱类杀虫剂的市场占有率仍然很高，这意味着各种非靶标生物仍会暴露于该类杀虫剂中[10]。目前，新烟碱类杀虫剂对生物毒性效应表征较多，而对致毒机理探究较少；对单一化合物暴露较多，而对多个化合物联合暴露较少[25]。今后应在如下几方面加强研究：(1) 结合多种分析手段在不同水平上揭示新烟碱类杀虫剂对不同水平物种生物的致毒机理；(2) 多种新烟碱类杀虫剂与其他农药联合暴露时对不同生物物种的毒性效应与机理。这些研究有助于进一步为新烟碱类杀虫剂的风险评估和合理施用提供科学依据。
本研究评价了新烟碱类杀虫剂对家蚕的急性毒性效应，但在农田生态系统中，农药的大量广泛使用，对桑叶及蚕室周围可能造成不同程度的轻度污染，家蚕有可能暴露到农药的慢性毒性[26]。研究发现，家蚕接触微量慢性毒性较大的农药后，虽然死亡率很低或者无死亡，但蚕体正常的生长发育和生理代谢受到干扰，造成眠蚕体质量下降、眠起不齐、发育历期延长等，同样会给养蚕业造成较大的经济损失[7]。因此，预防农药污染引起的家蚕慢性毒性也应受到重视。
本试验开展了9种杀虫剂对家蚕的初级风险评估。通过暴露分析、效应分析和风险表征研究，结果显示：在目前登记的田间最高施用剂量下以最外围桑树的桑叶饲喂家蚕，对家蚕的风险均不可接受；在以次外围桑树的桑叶饲喂家蚕，除马拉硫磷对家蚕的风险可接受外，其余均不可接受。在效应分析时，由于受环境条件等影响，仅用单个毒性测定值来计算预测无效应浓度，不一定能保证预测无效应浓度的数据质量。下一步可以考虑结合慢性试验，提高预测无效应浓度的数据质量。
风险评估结果显示，多次施药飘移场景下，以最外围桑树及次外围桑树的桑叶饲喂家蚕，新烟碱类杀虫剂对家蚕的风险均不可接受。由于其具有良好的根部内吸性，且残效期长，在桑园周边田间使用时，建议：一是在养蚕期间避免在蚕室和桑园附近使用该类药剂；二是桑叶采摘时注意施药安全间隔期；三是在蚕期可选择其他低毒性杀虫剂，如采用文中试验次外围桑树的桑叶饲喂家蚕风险较低的马拉硫磷替代。
