基因编辑技术在水稻抗病基因与育种研究中的应用进展

谭晓菁，王忠华，吴月燕，郑二松，徐如梦，陈剑平，王栩鸣，*，严成其，3，*

(1.浙江万里学院，浙江 宁波 315100； 2.浙江省农业科学院 农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，浙江 杭州 310021； 3.宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315100)

水稻是世界上重要的粮食作物之一，全球超过30亿人每天食用水稻[1]，大约7 000年前我国长江流域就已经开始种植[2]。我国有广大人口以水稻为主食，其固着生长的模式难以避免病虫害的侵袭，病害如白叶枯菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)、稻瘟菌(Magnaportheoryzae)、纹枯菌(Rhizoctoniasolani)等；虫害如二化螟、卷叶螟、褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱等，均给水稻生产带来了严重危害[3]。目前，农业生产上的主要手段是通过农药来防治病虫害，但农药的长期使用不仅会污染环境，还会造成谷物品质的下降，同时农药的不当使用还可能导致有害生物的抗药性增强、病虫害加剧[4]。植物的抗病反应受到多种信号通路的调控，其中包括正向调控和负向调控，因此可以考虑通过基因编辑手段敲除部分负调控植物抗病反应的基因来提高植物的抗病性。

近年来，快速发展的基因编辑技术为克服上述矛盾开辟了新道路。主要包括锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)[5]，类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)[6]，CRISPR/Cas系统(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas)[7]、单碱基编辑系统(base editing，BE)和引导编辑系统(prime editing，PE)[8]。利用基因编辑技术可使目的基因发生定向突变，从而获得具有目标性状的突变材料，其效率远超通过自发突变、化学诱变、物理辐射等其他突变方式，基因编辑技术能有效地避免连锁累赘效应，为各物种的基因编辑研究提供了前所未有的便利，因而引起世界研究人员的广泛关注[9]。

1 基因编辑技术概述

孟德尔等先驱的研究很好地展示了传统遗传学研究依赖于自发突变的发现和分析这一特点。Muller和Auerbach证明了通过辐射或化学处理可以提高诱变效率[10-11]，但这些操作在基因组中产生的并不是定向突变，直至20世纪后期，科学家们才成功完成了第一批靶向基因组突变[12-15]。基因编辑实质是在特定基因位点利用序列特异性核酸酶(sequence specific nucleases，SSN)打断染色体DNA，随后借助编辑受体自身的DNA修复系统在非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)过程中随机产生DNA片段的插入或缺失(small insertions and deletions，INDELs)或在同源重组连接(homologous recombination，HR)过程中随机产生的INDELs，最终导致基因序列的突变[16]。

1.1 ZFN基因编辑技术

锌指结构是很早就被科学家们发现的一类能与DNA互作的蛋白结构基元。ZFN由锌指蛋白构成的DNA识别域和FokⅠ蛋白构成的切割域组成，它可以打断靶位点的染色体DNA[17-18]。ZFN根据其组成锌指蛋白基元的种类及排列方式的不同来识别各种DNA序列[19]，其编辑效率受核酸酶的DNA亲和力影响。该技术已被成功应用于多种动植物体的基因编辑，在医学领域中也显示出极大的应用价值，在作物研究中也有典型的成功案例，如EXZACT Precision Technology已成功在小麦、玉米、大豆和棉花等主要作物物种完成精确突变并产生新颖且理想的表型[20]。

1.2 TALEN基因编辑技术

基于对TAL效应因子(TAL effector，TALE)的研究，科研人员发现了转录激活样效应因子核酸酶。TAL效应因子最初是在黄单胞菌分泌的效应蛋白中被发现的，该病原体的效应蛋白成功侵染植物细胞质后，通过靶定效应因子特异性的基因启动子来调节转录，从而影响植物的代谢过程，使其对病原物变得更加易感。TALEs酶可分为三部分：N段为信号生成结构域，中间为脱氧核糖核苷酸结合域，C端为核定位信号和启动结构域[21]。科研人员利用TALE具有序列特异性结合的特点将FokⅠ核酸内切酶与一段人造的TALE连接起来，形成一类兼具TALE和FokⅠ内切酶特性的强大工具，称为TALEN。该技术已被应用于动物、植物、微生物甚至人类自身的基因组编辑[22]。

1.3 CRISPR基因编辑技术

1987年，CRISPR基因座首次被鉴定为一组29 bp的串联重复序列，在大肠埃希菌中以 32 bp的DNA序列间隔排列[23]。后来，Mojica等[24]发现，细菌、古细菌及同源性较高的原核生物均具有结构相似且高度保守的重复序列。通过对古细菌和细菌基因组进行分析，将这类重复序列定义为CRISPR。数年后，CRISPR/Cas系统的生物学意义才被证实：CRISPR是原核生物基因组内的一段重复序列，包括一系列与之功能相关的蛋白[25]，并在原核生物对病毒感染的免疫过程中发挥作用[26]。同时根据编程酶的不同分为CRISPR/Cas系统和CRISPR/Cpf系统。

1.3.1 CRISPR/Cas系统

CRISPR/Cas系统由CRISPR序列元件和Cas家族组成，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型。三种类型的系统都具有识别和切割与crRNA互补的核苷酸序列的特性。其中CRISPR/Cas9是目前报道最强大的基因编辑工具，是唯一被优先应用于基因编辑的Ⅱ型系统[27]。该系统能够在植物基因组特定位点产生DNA双链断裂，通过NHEJ机制在修复目标基因的过程中引入DNA片段插入或缺失，从而产生定向突变。CRISPR/Cas9及其优化版本在动物、植物、微生物中均有相关应用[28-31]，同时在农作物的生产改良方面成果显著[32]，但Cas9蛋白特异性识别原间隔序列临近基序(protospaceradjacent motif，PAM)的特性限制其靶向性，影响了编辑效率和灵活性，一定程度上限制了它们在基因组编辑中的效率。

最新研究报道Walton团队设计了一种名为SpG的化脓链球菌Cas9变体，该变体几乎完全消除了PAM的限制，能够靶向更广泛的NGN PAM[33]。在进一步实验优化后Walton团队还开发出变体SpRY，两种新型Cas9变体让研究人员获得了与疾病相关的全新的遗传变异基因。新的实验突破性地实现了高精准靶向编辑，这为未来进一步深入探究物种基因功能提供了前沿技术支持。

1.3.2 CRISPR/Cpf系统

来源于CRISPR系统的3种Cpf1核酸内切酶AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1，都可用于水稻基因编辑[34-38]。CRISPR/Cpf1系统对CRISPR/Cas9系统起到了适当补充作用，前者为后者不能编辑的区域提供新的目标位点，使基因组可编辑区域进一步扩大；同时Cpf1识别靶位点只需一段较短的crRNA与CPF1蛋白，不需tracrRNA存在[39]。与Cas9不同，Cpf1自身能加工前体crRNA，这种利用加工crRNA的特异性靶向和切割目的DNA的能力可以进一步简化多重基因组编辑，提高编辑效率。总而言之，CRISPR/Cpf1系统的使用拓宽了基因组编辑的范围，扩展了农业研究的深度。

1.3.3 单碱基编辑系统

单碱基编辑技术是基于CRISPR/Cas9系统发展起来的新型靶基因修饰技术，其编辑系统不包切割活性的Cas蛋白(deactivated Cas， dCas)，或只有一条包含融合切割活性的Cas蛋白(nickase Cas， nCas)与脱氨酶的链来实现靶位点处碱基的定点替换。依据不同碱基修饰酶可以分为嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor， CBE)和嘌呤碱基编辑器(adenine base editor， ABE)[40]。CBE一般由胞嘧啶脱氨酶(APOBEC1)、nCas9或dCas9蛋白组成；而ABE工具则多是利用定向进化的腺嘌呤脱氨酶TadA融合nCas9蛋白构成。这两类碱基编辑系统利用CBE或ABE对靶位点进行精准的脱氨基反应，最终经DNA复制修复后，可以分别实现C-T(G-A)或A-G(T-C)的碱基替换[41]。较前几代基因编辑技术，BE编辑效率更高，脱靶率更低，灵敏度更高，更适应探索物种基因功能的现代研究。

首先，改进进度管理模式能够促进建筑工程整体质量的提升。在现代建筑工程施工过程中，涉及到的内容十分复杂，加之工程周期较紧，想要在规定的时间内保质保量的完成施工作业，必须做好进度管理工作。因此进度管理作为工程管理的一个方面，其所占的地位越来越重要。工程进度的顺利推进，不仅关系着工程成本，和工程质量也存在紧密联系，因此对进度管理模式进行改进可以为建筑工程整体质量的提升提供一定的推动作用。在具体施工中，建筑工程管理标准和要求若是得不到有效的落实，必然会对工程进度产生一定的影响，甚至威胁到建筑工程的使用寿命。

1.3.4 引导编辑系统

2019年10月，Anzalone等[42]报道了不同于碱基编辑的基因组精确编辑技术，即引导编辑系统(prime editing)。该系统将活性部分缺失的Cas9内切酶(nSpCas9)和工程化改造的逆转录酶(M-MLV RT)融合，直接将新的遗传信息写入指定的DNA位点。其实质是由pegRNA(primeediting guide RNA)中guide RNA靶定基因位点并由nCas9切割形成编辑链上的单链切口，进而通过pegRNA中的PBS(primer binding site)序列引导将含有目标编辑序列的逆转录模板将突变精确导入到基因组中。该实验组对人类细胞中进行了上百次的编辑，包括靶向插入，缺失和12种类型的点突变，实验不依赖双链断裂或供体DNA模板。目前以植物偏好密码子优化而来的植物引导编辑系统已被成功运用至水稻和小麦的DNA精确编辑中。

综上所述，不同基因编辑技术各有其优势和局限之处，如ZFN技术的编辑效率相较于同源重组有了较大提高，但锌指表达文库构建复杂，后续筛选工作量庞大，且在ZFN剪切突变DNA形成同源二聚体的同时，可能会产生异源二聚体形成脱靶效应，造成DNA的错配和序列改变，产生较强的细胞毒性，甚至引起细胞凋亡[43]；TALEN较一代基因编辑技术在成本、细胞毒性和脱靶率上有所降低，实验效率及特异性有所提高，但模块组装过程较为繁琐[44]。目前已有多种发展成熟的方法进行合成TALEN，如GOLDEN GATE组装法、基于长黏末端的LTC组装法、快速高通量固相合成法等；而CRISPR/Cas9系统较上述编辑技术又有了较大提升，该系统无需重新构建Cas蛋白，就能进行单个基因的多位点编辑，极大地简化了实验步骤，降低成本，有力地推进了生物工程和转基因技术的发展与应用，但在植物细胞中，由于同源重组频率偏低和DNA供体递送困难，其同源介导修复(homology-directedrepair，HDR)效率显著受限，难以实现高效的基因组精确编辑[45]；而在CRISPR/Cas9基础上发展而来的单碱基编辑技术，是新近发展的不依赖于HDR而介导的新型基因编辑技术，相比于之前的技术其编辑效率和灵敏度更高，脱靶率更低，但现有的碱基编辑器仅能完成特定的4种形式的碱基转换，缺乏完成精确可控的碱基转换或者片段插入缺失等其他基因组编辑的能力，但瑕不掩瑜，在多种植物中，CBE和ABE均可有效介导G-C-to-A-T的碱基转换，为植物基因组精确编辑提供了新的可行策略。此外，引导编辑技术更是对单碱基编辑技术的又一创新突破，它可完成12种任意类型的碱基替换，高效编辑PAM远端序列的多个位点，且编辑效率更高。CRISPR/Cas9和单碱基编辑技术彼此优势互补，这也是两者在近年来炙手可热的重要原因。

除上述基因编辑技术外，还有许多传统诱变技术和基于以上编辑技术加以创新突破的新的编辑方法，如反向遗传方法、SGN(structure-guided nuclease)等，反向遗传方法能通过定点突变某基因，研究其表型来确定该基因的功能，在作物改良计划中作用显著[46]。传统诱变方法的简单性和可行性以拟南芥为代表的小基因组的二倍体植物的功能基因组学研究提供了更多的便利，但是获得新品种需要较长的周期且实验成功率较低。总而言之，各类编辑技术都为功能基因组学的研究贡献了新的实验思路[47]。

2 CRISPR/Cas9在水稻抗病基因研究中的应用

基因编辑技术在医药，食品和工业生物技术方面应用广泛，在农业应用方面尤其是在水稻抗病育种中成果也十分显著。关于利用基因编辑技术培育高抗水稻是关乎全球粮食安全的战略性议题，具有重大的社会和经济学意义。其中CRISPR/Cas9系统在培育抗病水稻品种，完成到2050年可能达到97亿人口的庞大粮食需求问题中发挥着巨大的作用[48]。下文是对该技术在近些年水稻抗病基因研究中的部分成果概述。

水稻东格鲁病(rice tungro disease，RTD)是由水稻东格鲁球形病毒(rice tungro spherical virus，RTSV)和水稻东格鲁杆状病毒(rice tungro bacilliform virus，RTBV)共同感染引起的。Macovei等[49]研究发现，水稻对RTD的抗性与翻译起始因子4γ基因(eIF4G)紧密关联，且eIF4G对植株正常发育至关重要。在利用CRISPR/Cas9产生突变后，RTSV易感品种也能获得对RTD的抗性。研究发现，具有RTSV抗性的水稻株系在温室条件下产量提高，且最终产物不再包含Cas9序列，该实验中培育的新型抗RTSV的eIF4G等位基因突变体水稻株系说明选育多样化的抗RTSV水稻品种具有高度可行性，这为研究抗RTD水稻提供了新的方案。

武广珩等[50]利用CRISPR/Cas9成功创制了OsEDR1功能缺失突变体水稻株系。对其进行白叶枯病接种实验后发现，突变株系的病斑长度比对照组减少约50%，对白叶枯病的抗性明显增强。实验结果表明，OsEDR1负调控水稻对白叶枯病原菌的抗病防御反应且该反应途径可能与拟南芥所依赖的防御反应信号转导通路不同。同理，Ke等[51]、Liu等[52]利用CRISPR/Cas9技术分别敲除了基因OsEDS1和OsCUL3a，前者获得了水稻白叶枯病易感株系，后者则增加了植株对白叶枯病的抗性，但Oscul3a的突变体材料中只有1个突变体是有这样的表型，所以通过此技术获得的突变体材料可能会因为敲除的位点不同导致突变体材料之间产生差异，实验具有一定的偶然性，还需进一步验证和改良以增加目标性状植株的突变频率。以上实验为培育新型抗白叶枯病的水稻品系提供了新的基因资源，但同抗病基因OsEDR1、OsEDS1和OsCUL3a关联的上下游基因与信号转导通路还未明确，还需进一步研究。

水稻基因组中存在大量抗病调控基因，如OsEDR1、OsEDS1、OsCUL3a、Ob-fold、Pi21、OsWAK112d等[56-57]。根据已有的研究结果猜测，利用CRISPR/Cas9技术定向编辑这些抗病基因将有助于提升水稻抵抗病害侵害的能力。总而言之，探究水稻抗病基因其内在的基因功能与外在的性状表现，不仅有助于新型高质高抗水稻基因资源的进一步深入发掘，更是选育抗病新品种水稻的有效方法，具有重大的社会价值和经济价值。CRISPR/Cas9技术在水稻抗病基因研究方面发挥着巨大作用，也为探索其他动植物基因功能的研究者们引领了方向。

3 CRISPR/Cas9在水稻抗病新品种选育中的应用

稻瘟病是全世界影响水稻产量的毁灭性病害之一。相关研究表明，利用寄主抗性是控制稻瘟病最经济有效的方法。近年来，通过基因编辑技术改善作物性状、提高作物产量已被广泛认可，其中CRISPR/Cas9基因编辑技术被认为是提高水稻抗性和品质的最为有效的方法。如Wang等[58]以水稻空育131为实验材料，利用CRISPR/Cas9系统敲除其负调控稻瘟病抗性的类转录因子OsERF922，再通过农杆菌侵染愈伤组织的方法成功获得了抗稻瘟病株系。王芳权等[59]利用相同的实验方法对与抗稻瘟病相关的Pi21基因的两个靶位点进行编辑，两个靶位点突变效率均大于75%，鉴定发现突变株系均获得稻瘟病抗性。2020年Nawaz课题组也通过CRISPR/Cas9靶向诱变来产生突变体，其在T0代获得17株突变株，其中纯合突变率为22%。研究表明，其纯合突变体在不影响主要农艺性状的情况下，具有较强的抗稻瘟病能力[60]。这些结果揭示了基因组编辑的基本价值，同时也扩大了学者们对水稻真菌侵染的认识。

由水稻单黄胞菌致病变种Xoo引起的细菌性枯萎病是发生在亚洲水稻和非洲水稻中的重要病害，培育抗白叶枯病水稻品系是解决细菌性枯萎病最为有效的方案。水稻黄单胞菌致病变种Xoo分泌的转录激活因子效应物，可以结合特定的启动子序列从而诱导蔗糖转运蛋白表达来调节水稻的易感性[61]。CRISPR/Cas9介导的基因编辑在3个蔗糖转运蛋白基因启动子中引入突变。田间实验显示，3组SWEET突变均表现出显著抗病性[62]。Zhou等[63]利用CRISPR/Cas9技术敲除SWEET13基因(SWEET家族基因)，成功获得对米曲霉易感的突变株系。该实验进一步证实SWEET基因在水稻抗病防卫反应起到重要的调控作用。这也提示我们反向思考该如何减少水稻细菌性侵害，激发水稻原本存在的隐性抗性基因表达可能成为一个可行的方案。

Hong等[64]利用CRISPR/Cas9技术将水稻品种ZH11中参与MAPK级联反应的OsMPK15基因敲除，从而获得了对白叶枯病具有抗性的水稻植株。Osmpk15突变体较野生型的PR基因表达量升高，SA/JA的含量增加，活性氧含量上升，但是美中不足的是这个突变体的产量相比野生型有所下降。Yang等[65]研究表明，Os8N3是一个以Ⅲ型效应器PthXo1为靶点的白叶枯病宿主易感基因。因此，Kim研究团队希望通过CRISPR/Cas9技术敲除水稻Os8N3基因来研究水稻对白叶枯病的抗性，研究发现，纯合突变体对白叶枯病原菌的抗性显著增强，但在温室生长条件下，包括花粉发育、株高分蘖在内的农艺性状在纯合突变体与野生型之间并没有显着差异[66]。

综上所述，CRISPR/Cas9技术在抗病新品种选育上起到了巨大作用，为研究水稻抗白叶枯病、抗稻瘟病、抗细菌性条斑病等提供了有力的技术支持，积攒了丰富的理论资源和实验素材。通过提高水稻抗病害能力以提高其产量是满足全球粮食需求所必需的重要手段，CRISPR/Cas9技术为几年后可能面临的人口大量增长而导致的全球粮食安全危机问题提供了一个有效的解决方法。

4 前景与展望

基因编辑技术带来的众多便利将改变植物基础研究和作物育种的面貌。基因编辑可以通过靶向突变来研究基因功能，通过形成新的基因突变体来发现新性状，它还可以通过基因叠加简化并加速新性状的引入和复杂性状的保持。对生产部门而言，这意味着产品质量更高，成本更低，劳动力更少。对消费者而言，这项新技术意味着将以更低的消费获得更多且更有营养的食物。这同CRISPR/Cas9技术在改良水稻抗病性状与分子育种方面所展露出的积极作用相同。因此，未来结合CRISPR/Cas9技术的新型抗病育种研究可能得到大量的应用与推广，从水稻上获得的改良农艺性状的知识可以作为一个模型系统外推到其他谷类作物[67]，从而帮助我们更加有效、精准、快速地培育优质抗病高产新作物。

CRISPR/Cas9基因编辑技术由于成本低廉、操作方便、效率高等优点，迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手，并在多种植物中得到广泛应用，也为水稻抗病基因功能研究与作物遗传性状改良做出了重要贡献。但研究人员也注意到该技术会产生非预期的效应和未知变化等问题，如果基因编辑产物比野生型更适应环境，一旦群体进入自然，可能会对其他物种产生影响。不过随着科学研究不断深入，相信该技术能够更加安全、合理、广泛地应用于各个领域。与此同时，还有更多的未知领域需要探索。目前基因编辑技术体系仍有诸多技术难题尚未解决，如发展更为高效精准的基因编辑系统，推广建立多重基因编辑体系[68]，优化突变检测技术等仍将是今后的努力方向。