甘草苷对急性灌酒小鼠肝损伤的保护作用

张芬芬，程梦迪，周珊珊，柳金可，王 荣

（阜阳师范大学 胚胎发育与生殖调节安徽省重点实验室，安徽 阜阳 236037）

急性酒精性肝损伤发病机制复杂，乙醇及其毒性代谢产物、脂质过氧化、氧化应激、炎性反应等均参与其中[1]严重者还会因急性酒精中毒而死亡。急性酒精性肝损伤是由于过量饮酒所导致肝脏代谢紊乱，且目前其发病率逐年升高[2]。在我国,酒精性肝病仅次于病毒性肝炎，已成为引起肝功能损害的第二大病因[3]。因此酒精性肝损伤已经严重影响人类健康。现代药理研究表明，甘草具有明显的抗炎、镇咳、平喘等作用[4-5]。甘草苷(Liquiritin，LIQ)作为一种单体活性物质是甘草中的主要黄酮类化合物，具有抗抑郁，保护神经、心脏系统等多种药理活性[6]。Ji-Yeon Yu[7]等人研究表明甘草苷能抑制叔丁基过氧化氢模型小鼠肝脏促炎细胞因子的表达水平，可用于治疗炎症相关疾病，陈云华[8]等人研究了甘草苷对醋氨酚人肝细胞损伤模型具有一定的保护作用，但甘草苷对急性酒精性肝脏损伤是否具有保护作用尚不明确。因此，本实验拟通过检测添加甘草苷后急性灌酒小鼠血清中ADH 水平，肝脏中ADH、MDA、SOD水平来研究甘草苷对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康KM 小鼠50 只，雄性，体重30～35 g，由浙江维通利华实验动物技术有限公司桐乡分公司提供，许可证号:SCXK(浙)2020-0002，合格证号：20210126Abzz0600000382。

1.2 主要试剂及仪器

甘草苷(北京索莱宝科技有限公司)，无水乙醇(阿拉丁加蒸馏水稀释备用)，Bradford 法蛋白检测试剂盒、乙醇脱氢酶(ADH)测试盒、总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测试盒（南京建成生物工程研究所），精密分析天平（Mettler Toledo）、低温离心机（Eppendord）、酶标仪（Tecan）。

1.3 动物分组、给药与造模

实验小鼠饲养环境21～23℃，50 只健康KM小鼠适应性喂养一周。按体重随机分为对照组、酒精组及给药组（甘草苷低、中、高三个剂量组）共五组[9]，每组10 只。每天1 次，连续7 d 灌服给药。对照组、酒精组分别按与给药组等体积灌服蒸馏水，其余各组分别灌服相应剂量甘草苷(分别为低剂量组10 mg/kg，中剂量组20 mg/kg，高剂量组40 mg/kg)，第7 d 末次给药后1 h，除对照组外其余各组按12 ml/kg 剂量一次性灌胃50%酒精（用无水乙醇稀释，下同)造模[10]建立小鼠急性酒精性肝损伤模型，灌胃50%酒精后小鼠禁食不禁水。

1.4 指标检测及方法

1.4.1 状态观察

观察各组动物的一般情况，包括精神、活动状况、饮食、排便等。

1.4.2 血清生化指标测定

第7 d 灌胃酒精造模成功12 h 后，眼球静脉取血，血液静置1 h，4℃低温下进行离心，4000 r/min 离心10 min 后取上清液，根据乙醇脱氢酶(ADH)测试盒测ADH 活力。

1.4.3 肝脏生化指标测定

第7 d 灌胃酒精造模成功12 h 后，脱颈处死解剖取肝脏，研磨成10%的肝组织匀浆4℃低温下进行离心，4000 r/min 离心10 min 后取上清液，根据乙醇脱氢酶(ADH)测试盒、总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测试盒测ADH、MDA、SOD 含量和活力。

1.5 统计学方法

采用GraphPadPrism8 统计软件进行差异显著性分析，计量资料以(Mean&SEM)表示，各组间比较采用(one-way ANOVA)检验。检验水准:a=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 状态观察

造模前小鼠生活状态正常，毛色光泽，黑褐色颗粒样大便;进食及饮水均正常。给予酒精造模后，除正常对照组外，其余各组小鼠先表现为行动缓慢，转而进入嗜睡醉酒状态，进食少，毛散乱。

图1 血液各组ADH 活力。A.正常组，B.酒精组，C.甘草苷低剂量组，D.甘草苷中剂量组，E.甘草苷高剂量组。

2.2 血清指标的比较

实验结果显示，酒精组与对照组比较，其血清ADH 水平均有升高，表明造模成功，小鼠经一次性灌胃50%酒精后出现肝脏损伤；甘草苷各剂量组与酒精组比较，小鼠的血清ADH 水平均升高(p＜0.05)；甘草苷各剂量组之间比较，差异无统计学意义。

2.3 肝功能指标的比较

酒精组与对照组比较，其肝脏ADH 水平有所升高，甘草苷低、高剂量组与酒精组比较，小鼠的肝脏ADH 水平均升高(均p＜0.05)；酒精组与对照组比较，其肝脏SOD 水平有所降低，甘草苷中剂量组与酒精组比较，小鼠的肝脏ADH 水平差异不明显。甘草苷各剂量组与酒精组比较，小鼠的肝脏SOD 水平均升高(均p＜0.05)；酒精组及给药组与对照组比较，其肝脏MDA 水平整体趋势呈现无显著性差异，甘草苷中剂量组MDA 值升高可能存在一定的偏差。综合表明甘草苷对酒精损伤的肝脏有一定的保护作用。

图2 肝脏各组ADH 活力。A.正常组，B.酒精组，C.甘草苷低剂量组，D.甘草苷中剂量组，E.甘草苷高剂量组。）

图3 肝脏各组SOD 活力。A.正常组，B.酒精组，C.甘草苷低剂量组，D.甘草苷中剂量组，E.甘草苷高剂量组。）

图4 肝脏各组MDA 含量。A.正常组，B.酒精组，C.甘草苷低剂量组，D.甘草苷中剂量组，E.甘草苷高剂量组。）

3 讨论

酒精性肝病的发病机制复杂，肝脏是酒精代谢最主要的器官，酒精进入肝脏首先在乙醇脱氢酶的作用下代谢为乙醛，再通过乙醛脱氢酶代谢成乙酸，最后分解成水和二氧化碳排出体外[11]。过量饮酒肝脏代谢负荷增大，不能及时将有害物质分解排除体外，因此会引起细胞内相关代谢通路紊乱，使肝细胞产生炎症反应和氧化应激反应，导致肝脏脂质化、纤维化等，从而诱发肝细胞损伤[12-13]。过量的乙醇摄入可降低肝脏内抗氧化系统的活性，减弱SOD 等抗氧化能力，破坏机体的氧化和抗氧化平衡，引起氧化应激，导致脂质过氧化的连锁反应，以及线粒体功能损伤、内质网应激和免疫炎性反应等引起的肝损伤[14]。MDA 是脂质过氧化的重要产物，其含量高低可反映机体内脂质过氧化的强度[15]，酒精性肝损伤过程中肝脏内氧化应激标志物如MDA、SOD 等的含量均明显改变。短时间大量饮酒会损伤肝组织，主要和抗氧化损伤、脂质过氧化及免疫损伤等因素相关[16]，降低肝脏的氧化应激反应，从而达到醒酒护肝作用是近年来中医药研究的热点[17]中药及其有效成分[18]具有改善肝功能、减轻氧化应激损伤[19]、调节免疫功能、减少炎症、减少细胞凋亡、保护肝脏免受损伤的作用。这些研究为今后开发保肝药物奠定了基础[20]。甘草中的主要成分为三萜类和黄酮类，其中甘草苷是黄酮类化合物中重要的单体活性成分，具有很强的药理活性[6]。甘草苷通过促进细胞凋亡以剂量依赖的方式抑制肿瘤生长[21]。甘草苷能够通过双重抑制TRPV_1 和TRPA_1 通道介导，表现出抗炎镇咳作用[22]。甘草苷通过ROS 介导的丝裂原活化蛋白激酶/Akt/NFκB 信号通路抑制肝癌细胞增殖并诱导其凋亡[23]。因此探究甘草苷对急性灌酒小鼠肝损伤的保护作用具有重要的研究意义。

本实验结果显示应用甘草苷可以显著提高血清和肝组织中ADH 和SOD 水平，当血液中的乙醇浓度过高时，乙醇主要通过ADH 代谢系统进行氧化，而提高ADH 活力可以加速乙醇的代谢过程，可见甘草苷具有解酒功能。检测肝脏各组ADH 活力时，甘草苷中剂量组与酒精组相比差异不明显，但相对于酒精组还是有一定的提高，可能是由于一定的偏差造成，但具体原因还需进一步探究。SOD 是作用于超氧阴离子自由基的专一歧化反应催化剂，SOD 作为医药产品，在治疗因自由基作用而导致的炎症、自身免疫性、心脑血管疾病等都有着显著疗效。[24]SOD 可利用其抗氧化作用抑制炎症反应，甘草苷能够提高机体SOD 活力，表明其能增强机体抗氧化作用，说明甘草苷对肝脏损伤具有一定的保护作用。本实验采用的方法是单次大量高浓度酒精灌胃构建急性酒精性肝损伤模型，结果显示酒精组小鼠血清和肝脏中ADH水平均有所升高，说明机体在接受大量酒精时，自身进行了一定的代谢过程。酒精组肝脏SOD 活力有所下降，说明机体一次性饮用大量酒精会降低自身的抗氧化能力。给药组SOD 活力升高说明给药后提高了机体清除氧自由基的能力，而各组MDA 含量未显示出显著性差异，可能是由于急性灌酒后短时间内机体细胞受自由基攻击的严重程度差异还未明显表现。甘草苷对急性酒精性肝损伤具有一定的保护作用，这可能与甘草苷可在一定程度上改善脂质过氧化、增强受损肝脏抗氧化能力、减少炎症反应有关，其作用机制需要更进一步的研究探索。