基于光源切换的发光二极管诱导荧光检测器的研制与评价

王丰琳，周新颖，王文晶，杨三东，唐 涛，李 彤*

（1.大连依利特分析仪器有限公司，辽宁 大连 116023；2.大连市色谱工程技术研究中心，辽宁 大连 116023；3.中国科学院 苏州生物医学工程技术研究所，江苏 苏州 215163）

荧光检测方法主要利用被检测物质在紫外光照射时产生荧光，通过测试荧光响应达到检测目的，此方法能有效消除其它基质的干扰，并具有很好的响应稳定性。因此荧光检测器具有灵敏度高、选择性好的特点，在高效液相色谱中得到广泛应用。如周雯鹂等［1］使用高效液相色谱－荧光检测法测定塑料儿童玩具中4种苯并唑类荧光增白剂。余晓琴等［2］使用高效液相色谱－荧光检测法测定水果中乙氧基喹啉。陈坤等［3］使用荧光衍生化和高效液相色谱－荧光检测法测定水和蔬菜中挥发性异味物质等。目前使用的荧光检测器多依赖于进口的通用型荧光检测设备，该类设备通常由激发光和发射光两组单色器及多个光栅、狭缝、透镜组成，其结构复杂、成本高、占用仪器空间较大［4］。其中，激发光源是荧光检测设备的关键部件，传统的激发光源（如氙灯）存在体积大、能耗高、寿命短等问题［5］。激光由于具有极佳的单色性及高激发能量，近年来，通过共聚焦光路结构［6－7］将激光作为激发光源的激光诱导荧光检测器得到了极为广泛的应用［8－9］。

发光二极管（LED）作为一种近年来发展迅速的光学产品，因具有能耗低、寿命长、稳定性强、体积小以及成本低等优点，在荧光检测方面得到广泛应用［10－13］。LED 光源的光谱带宽通常为10～20 nm，而不同物质检测所需的激发波长往往相差几十甚至上百纳米，所以使用单一的LED 光源无法满足多种物质检测的需要，仅能作为某单一物质的专用检测器使用，极大地限制了该类设备的应用范围。

近年来，国内外有很多关于诱导荧光检测器的研究，以光路结构区分，有正交式、共聚焦式、斜入式、透射式四种主要结构。正交式是指激发光路和发射光路相互垂直，具有两套光学系统，因此其存在的空间位阻问题会影响荧光信号的收集［14］；共聚焦结构指激发光路和发射光路成180°，其主要优点在于光路结构中只有一套光学体系，因荧光收集率高以及杂散光低等优点［15］被广泛应用；斜入射式和透射式结构主要应用于微芯片系统中［16］。本文采用经典的共聚焦光路结构，设计了一款新型LED 多波长荧光检测器。通过对电机的分步控制，实现了多波长检测功能，解决了波长单一问题；并通过电机多重校准定位与光源滑动定位技术，解决了多光源的精准定位问题；以340、365、385 nm 高功率紫外LED 作为激发光源，共用一套发射光路，可同时对多种真菌毒素和苯并（α）芘进行检测，拓展了其应用领域；并对研制的检测器进行了系统评价，在基本性能、应用实验和环境测试方面均取得了良好的结果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LED多波长荧光检测器，P3100高压恒流泵，S3100自动进样器，O3100色谱柱恒温箱，PD3100光化学衍生器，Kromstation 色谱数据工作站，Supersil ODS2 色谱柱（4.6 mm×150 mm i.d，5 μm）均购于大连依利特分析仪器有限公司。

甲醇、乙腈（色谱级，美国Sigma 公司）；乙酸（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；标准品：黄曲霉毒素B1（2.0 μg/mL，农业部环境保护科研监测所）；赭曲霉毒素A（10.0 μg/mL，O2Si）；苯并（α）芘（纯度为98.8%，Dr.Ehrensorfer公司）；纯水（Synergy，i国Millipore公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 赭曲霉毒素A 取1 mL 10.0 μg/mL 的赭曲霉毒素A 置于50 mL 容量瓶中，用甲醇－乙腈（体积比1∶1）稀释定容，配制为200.0 ng/mL 的储备液，再用流动相稀释成质量浓度分别为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的对照品溶液。

色谱条件：激发波长和发射波长分别为340 nm 和440 nm；流动相为乙腈－水－乙酸（体积比96∶102∶2）；流量为1.0 mL/min；柱温为40 ℃；进样体积为20 μL；色谱柱为Supersil ODS2（4.6 mm ×150 mm i.d，5 μm）。

1.2.2 黄曲霉毒素B1取1 mL 2.0 μg/mL的黄曲霉毒素B1置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，配制为80.0 ng/mL 的储备液，再用流动相稀释成质量浓度分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、

20.0 ng/mL的对照品溶液。

色谱条件：激发波长和发射波长分别为365 nm 和440 nm；流动相为甲醇－乙腈－水（体积比20∶20∶60）；其余条件同上。

1.2.3 苯并（α）芘 准确称取10.0 mg 苯并（α）芘置于100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解、定容至刻度，得到100.0 μg/mL 的标准溶液，用乙腈稀释得到1 000.0 ng/mL 的储备液，再用流动相稀释成质量浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的对照品溶液。

色谱条件：激发波长和发射波长分别为385 nm和440 nm；流动相为乙腈－水（体积比90∶10）；其余条件同上。

2 结果与讨论

2.1 LED多波长荧光检测器的研制

2.1.1 光路与成像模拟 LED多波长荧光检测光路系统采用共聚焦光路设计，使用Zemax光学设计软件进行光路模拟（图1）。经过优化，系统消除了离焦现象，从光线追迹（图2A）及点列图（图2B）可知均方根半径（RMS）从8 334 μm 减小到154 μm，艾里斑由5.91 μm 减小到1.83 μm，当艾里斑直径小于2.44×F×主波长时，系统的设计满足要求，此时光学系统的艾里斑直径理论值大小为1.87 μm，LED多波长荧光检测光路成像的艾里斑直径小于此值，说明设计符合要求，成像分辨率更好，能量更加集中，球差显著减小。

图1 光路的模拟结果Fig.1 Result of optical path simulation

图2 光路成像分析结果Fig.2 Result of optical path imaging analysis

2.1.2 光源定位 多LED 光源切换，其核心在于光源切换后，能够精准定位，进而保证检测的重复性与一致性。本设备采用粗定位和精定位两级光耦确定原点位置；电机采用128 细分步方式控制，最小步进角度低至0.014°；采用高分辨率编码器，保证光源系统中心位置的精确定位，当位置与设定不相符时，硬件电路会自动计算并进行距离补偿。

为增强多LED 光源切换的可靠性，设计坐标板定位系统（图3）。采用红外激光器替换LED 光源的方式，其中，激光器的发散角度为1°，将光程放大至1 m 的距离，激光器投影至坐标板上的纵向位移为8.75 mm，针对LED 光源切换机构进行不间断连续切换。总计运行周期为3 万个周期时，光源系统中多个光源中心定位重复性良好，激光器的靶点位置误差在±0.2 mm以内，实现了LED光源定位的准确性和良好的重复性。

图3 多波长LED光源自动切换系统切换周期可靠性测试Fig.3 The reliability test of automatic switching cycle of multi-wavelength LED light source

2.1.3 结构设计 本设备主要由多波长LED 光源自动切换系统、共聚焦专用样品池、共聚焦式荧光光路系统、荧光探测系统、数据放大采集系统及计算机组成。

光源采用高功率紫外LED 灯，具有单色性好、能耗低、寿命长、封装小及节能环保和散热结构简单等优点。其包含多个LED 光源，可实现光源和滤光片的智能切换，以及高精度定位的功能（图4）。因此可以根据实际需求选配指定波长的光源。本系统中主要包括340、365、385 nm 波长的高功率紫外LED 光源，并通过共聚焦光路系统将激发光聚焦至样品处，再对样品发射出的荧光进行高效收集，从而既保证激发光的能量足够强，又极大地降低了背景光。最后将激发出的荧光弱信号采用高灵敏度、低暗电流的光电倍增管进行探测。数据放大采集系统对探测的荧光弱信号进行放大、滤波、模数转换，再由高效率单片机系统进行数据处理运算，并与上位机计算机拟定合理的通讯协议，对荧光信号进行采集。

图4 多波长LED荧光检测器的光源切换系统Fig.4 Light source swithching system diagram of multi-wavelength LED fluorescence detector

2.2 LED多波长荧光检测器的评价

2.2.1 噪声与漂移 噪声与漂移是衡量荧光检测器性能的主要指标。本文参考国家标准《JJG 705－2014 液相色谱仪》［17］及《GB/T 26792－2011 高效液相色谱仪》［18］，以甲醇为流动相，基线噪声以“峰对峰计算法”计算，漂移为1 h 内基线的最高峰值与最低峰值之差。通过试验，得到LED 多波长荧光检测器在340、365、385 nm 3个激发光源的基线噪声在每个灵敏档均低于5×10－4FU，漂移低于5×10－3FU/h（见表1）。

表1 LED多波长荧光检测器的噪声与漂移Table 1 Noise and drift of LED multi-wavelength fluorescence detector

2.2.2 线性范围与检出限 分别以赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、苯并（α）芘为检测对象，考察检测器对其线性范围和检出限情况。取“1.2”的对照品浓度，按照“1.2”色谱条件，对3 个激发光源（340、365、385 nm）进行线性考察，以峰面积为纵坐标（Y，mFU·s），对照品的质量浓度为横坐标（X，ng/mL）进行线性回归。由表2可知，赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、苯并（α）芘分别在1.0～50.0、0.1～20.0、0.5～20.0 ng/mL 范围内均呈良好的线性关系，相关系数（r2）均大于0.999 9；3种待测物的色谱图如图5所示，以3倍信噪比（S/N=3）为基准，将标准溶液逐级稀释，得到3种待测物的检出限（LOD）分别为0.06、0.01、0.02 ng/mL，方法的灵敏度符合分析要求［19－21］。

表2 赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1及苯并（α）芘的线性范围、相关系数及检出限Table 2 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients（r2）and LODs of ochratoxin A，aflatoxin B1，and benzo（α）pyrene

图5 赭曲霉毒素A（A）、黄曲霉毒素B1（B）及苯并（α）芘（C）的色谱图Fig.5 Chromatograms of ochratoxin A（A），aflatoxin B1（B）and benzo（α）pyrene（C）

2.2.3 重复性与可靠性 为了进一步验证检测器的重复性和可靠性，以赭曲霉毒素A（50.0 ng/mL）、黄曲霉毒素B1（40.0 ng/mL）、苯并（α）芘（20.0 ng/mL）为测试样品，在“1.2”色谱条件下，分别考察检测器在3 个激发光源（340、365、385 nm）下的重复性。结果显示，保留时间的重复性（RSDn=11）小于0.5%，峰面积的重复性（RSDn=11）小于1.0%。

以340 nm 光源为测试对象，分别考察检测器在震动、高温和低温环境下的本身性能和对样品响应值的变化情况。结果显示，在这3种环境下，检测器的基本性能未发生明显变化（见表3）。

表3 检测器的可靠性测试结果Table 3 The reliability test results of detector

2.2.4 与市售荧光检测器的对比 对比了本文的荧光检测器（以下简称本检测器）与市售商品化进口通用性荧光检测器A 和B（以下简称进口A 和进口B）的基本性能及其检测赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1、苯并（α）芘的差异性。

进口A 的基线噪声和漂移测试方法参考国家标准《JJG 705－2014 液相色谱仪》［17］及《GB/T 26792－2011 高效液相色谱仪》［18］，与本检测器在3 个光源下的基线噪声和漂移对比结果见表4。结果显示，本文的荧光检测器在3个光源下的基线噪声和漂移指标相当。

表4 本检测器与进口A基线噪声和漂移的对比结果Table 4 Comparison of the baseline noise and drif for the instrument in this paper and the import A

以赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1和苯并（α）芘为检测对象，对比本检测器与进口A 和进口B 对其检测的差异性。结果显示，在实验条件一致的情况下，本检测器对赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1和苯并（α）芘的检出限与进口A 和进口B 均在同一数量级（见表5）。表明本检测器对3种物质的检测灵敏度与市售进口通用性荧光检测器A和B相当。

表5 本仪器与与进口仪器测试结果的对比Table 5 Comparison results of the instrument in this paper and the imported instruments

3 结 论

本文研制了一款LED 光源的多波长诱导荧光检测器，以真菌毒素及苯并（α）芘作为探针进行了系统评价，并与市售商品化进口通用性荧光检测器进行对比。结果表明，该检测器对赭曲霉素A、黄曲霉毒素B1、苯并（α）芘的检出限分别为0.06、0.01、0.02 ng/mL，且基线噪声低于5.0×10－4FU，漂移小于5.0×10－3FU/h；与市售商品化通用性荧光检测器的检测性能相当。本文的检测器具有结构简单、波长覆盖范围更宽、性能良好和成本低的特点，对真菌毒素和苯并（α）芘的检测具有良好的应用前景。