不同发育期鸡呼吸道相关淋巴组织中IL-2和IFN-γ mRNA表达水平的变化规律

杨树宝，张桂山，徐 晶，张英楠,3* (.吉林医药学院，吉林 吉林市 3203；2.吉林农业大学 动物科技学院，吉林 长春 308；3.长春科技学院 生命科学院，吉林 长春 30600)

呼吸道相关性淋巴组织(RALT)是黏膜相关性淋巴组织(MALT)的重要组成部分，MALT同时也包括肠道相关淋巴组织以及泌尿生殖道相关淋巴组织[1]。由于鸡没有外周淋巴结，所以MALT成为主要的次级免疫器官，对禽类的免疫保护起重要作用[2]。伴随着呼吸道结构和功能的一系列转变，RALT也发生着相应的变化。由于鸡出壳后需要立即呼吸，从而呼吸道会接触到与成鸡接触类型一致的混于空气中的微生物群，且极有可能接触到病原菌，而此时的雏鸡呼吸道并未建立获得性免疫的保护，鸡在出壳后，母源抗体非常有限，因此，鸡如何在出壳初期保护自身不受病原体侵扰，RALT发育及功能是否成熟，能否给呼吸道及机体提供免疫保护等问题值得研究。

IL-2是由激活的Th1细胞分泌产生的一类重要细胞因子之一，能抑制Th2型细胞发育，选择性增强Th1型细胞分化增殖，亦能诱导T、B细胞增殖分化，促进自然杀伤细胞产生细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤的作用[3]。IFN-γ是由活化的T淋巴细胞和NK细胞等分泌的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物活性的重要细胞因子，能直接促进T、B淋巴细胞的分化，增强MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子的表达，是重要的免疫调节分子，常被用作感染机体的细胞介导免疫的指示器[4]。由于Th1细胞主要介导细胞免疫反应，其中起主要作用的是细胞因子IL-2和IFN-γ，因此本试验利用实时荧光定量PCR方法检测不同时期RALT中IL-2和IFN-γ mRNA的表达水平，在一定程度上反映不同时期鸡RALT的细胞免疫功能变化情况，从而为研究鸡出壳初期的免疫机制及鸡呼吸道疾病(尤其是禽流感)的防治以及研制有效的鼻腔免疫疫苗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物200枚海兰褐蛋鸡SPF种蛋，购自吉林卓越生物科技有限公司。

1.2 主要试剂及仪器RNAisoTMPlus、PrimeScript RT-PCR Kit、pMD®18-T 载体和SYBR®PrimeScript RT-PCR KitⅡ均购自大连宝生物；AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit 50-prep购自美国AXYGEN BIOSCIENCES；E.N.Z.A®Gel Extraction Kit 购自Omega公司。

依爱EIF/C.DME3456孵化机/出雏机(中国)，NanoDrop 超微量高精度紫外/可见光光度计，Eppendorf 冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，Eppendorf AG，22331Hamburg梯度PCR仪，ABI Applied Biosystems StepOne实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.3 引物设计与合成根据GenBank中登录的chIL-2、chIFN-γ和chβ-actin的序列，在保守区域分别设计1对特异性引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 IL-2、IFN-γ和β-actin的特异性引物

1.4 试验设计利用孵化器对种蛋进行孵化，孵化温度：37.5～38.2℃，湿度：60%～70%，每2 h自动翻蛋1次，出壳后，雏鸡进行常规饲养。分别在15，18，20胚龄及1，4，7，14，21，35，56，90日龄，每个时期分别取5只鸡胚或雏鸡的气管、喉和肺脏等组织，液氮速冻后-80℃保存备用。

1.5 总RNA提取与反转录按照RNAisoTMPlus (D9108A)说明书提取鸡呼吸道各段组织的总RNA。参照反转录试剂盒(DRR037A)说明书进行RNA反转录，合成cDNA。

1.6 阳性标准品的制备以35日龄雏鸡的肺脏cDNA为模板，对IL-2、IFN-γ和β-actin基因进行普通PCR扩增，目的基因经1%凝胶电泳后按照E.N.Z.A®Gel Extraction Kit说明书进行回收纯化，然后将回收纯化后的IL-2、IFN-γ和β-actin DNA与pMD 18-T载体进行连接、转化至宿主感受态菌DH5α，将IL-2 、IFN-γ和β-actin阳性克隆进行序列鉴定，测序结果与在GenBank中登录的鸡IL-2 mRNA (AF000631)，IFN-γ mRNA (X99774)及β-actin mRNA (X00182)的保守序列进行比对，运用DNAStar进行同源性分析。用核酸蛋白分光光度计测定IL-2、IFN-γ和β-actin DNA片段的阳性质粒D值，按照以下公式计算质粒拷贝数：

ds DNA拷贝数=

每一种阳性质粒分别进行10倍滴度稀释，每个稀释度设3个平行。

1.7 标准曲线的绘制采用SYBR GreenⅠ荧光染料法，以IL-2、IFN-γ和β-actin阳性标准品进行10倍梯度稀释(1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5)浓度为模板，进行荧光定量PCR反应。不断对模板浓度、引物浓度和退火温度等进行优化，以出现最小Ct值和最高荧光强度为标准，最后计算Ct值，取5个点绘制3个基因的标准曲线。

1.8 样品中目的基因的实时荧光定量检测将方法1.5中得到的不同日龄呼吸道各段组织的cDNA进行荧光定量PCR，以检测IL-2和IFN-γ mRNA的含量。各基因的反应体系均为20 μL，反应条件：95℃ 10 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，35个循环。

1.9 结果分析以20胚龄鸡胚呼吸道RALT中目的基因mRNA相对表达水平为1，根据各时期IFN-γ和IL-2基因mRNA相对表达水平与20胚龄目的基因mRNA 相对表达水平的差异倍数进行统计分析，从而阐明不同发育阶段鸡RALT中IFN-γ和IL-2基因的动态表达情况。

2 结果

2.1 IL-2基因mRNA表达水平的动态变化由图1A可见，胚胎时期肺脏中IL-2基因mRNA表达水平较低，且无明显变化，出壳后1日龄时其表达水平明显增加，约为胚胎时期的2倍。7～21日龄，IL-2基因mRNA表达水平持续显著增加(P<0.05)，到21日龄时其表达水平是胚胎时期的60倍左右，达到高峰。35日龄时虽有所下降，但56，90日龄时又上升至接近21日龄时的表达水平。

由图1B可见，喉RALT中IL-2的mRNA表达水平在胚胎时期和出壳后1日龄时均较低，4日龄时增加至胚胎20日龄表达水平的3倍，14日龄时，其表达水平较之前日龄显著增加(P<0.05)，达到峰值。随后的21，35日龄较14日龄的表达水平下降，56，90日龄时虽有所增加，但是仍然低于14日龄。

A.肺脏;B.喉图1 不同发育阶段鸡RALT中IL-2基因mRNA表达水平的动态变化

本试验在所有日龄组鸡的气管中均未检测到IL-2 mRNA的表达。

2.2 IFN-γ基因mRNA表达水平的动态变化由图2A可见，胚胎时期肺脏中IFN-γ mRNA的表达水平较低，1，7日龄时较胚胎时期增加10～20倍，14日龄时又比1日龄高出近35倍，但21日龄时又比14日龄显著下降(P<0.05)，此后日龄的表达水平又迅速增加，尤其是56日龄比14日龄高出3倍左右。

由图2B可见，喉中IFN-γ基因mRNA表达水平在胚胎期和出壳后1日龄时均较低，4日龄时比胚胎20日龄显著增加了13倍(P<0.05)，7日龄时明显下降，但14日龄又增加至与4日龄接近的表达水平，此后至35日龄，表达水平无明显变化。56日龄时，其表达水平突然增加至4日龄时的20倍左右，而90日龄时又显著下降(P<0.05)。

A.肺脏；B.喉；C.气管图2 不同发育阶段鸡RALT中IFN-γ基因mRNA表达水平的动态变化

由2C可见，胚胎时期一直到出壳后14日龄，气管中IFN-γ的表达水平均比较接近，且表达量都很低，21～56日龄时，表达水平逐渐增加，但是变化幅度较小，56日龄时，表达水平大概是胚胎20日龄时的4倍左右，但90日龄时，表达水平迅速增长至43倍左右。

2.3 不同器官中IL-2和IFN-γ mRNA表达水平变化规律的比较由图3A可见，鼻、喉和肺脏中IL-2 mRNA表达水平随着日龄增长，整体变化趋势相似，均随着日龄增长表达水平逐渐增加，并在21日龄时基本稳定。其中，各日龄鼻和喉中IL-2 mRNA表达水平比较接近，且表达水平均较低，随日龄增长，变化幅度较小，而肺脏中IL-2 mRNA表达水平从7日龄开始就显著高于鼻和喉，21日龄时表达水平比鼻和喉高10倍左右。

由图3B可见，各日龄鼻、喉、气管和肺脏中IFN-γ mRNA表达水平变化趋势与IL-2相似，随着日龄增长表达水平逐渐增加，且4种器官中以肺脏表达水平最高，而气管最低，鼻和喉接近，并在56，90日龄时达到较高表达水平，但仍显著低于肺脏。

A.IL-2；B.IFN-γ图3 不同器官中IL-2和IFN-γ mRNA表达水平的变化规律

2.4 不同发育阶段鸡同一RALT中IL-2和IFN-γ基因mRNA表达水平的比较由图4A可见，胚胎20胚龄和出壳后1～7日龄时肺脏中IL-2和IFN-γ基因mRNA表达水平均比较接近，但从14～90日龄，各时期IFN-γ基因mRNA表达水平均远高于IL-2，特别是14，56，90日龄IFN-γ基因mRNA表达水平分别高于IL-2 10，30倍左右。

由图4B可见，除4日龄时IFN-γ基因mRNA表达水平显著高于IL-2 4倍左右外，其他各个时期喉RALT中的IL-2和IFN-γ基因mRNA表达水平均比较接近。此外，由于56日龄时IFN-γ的增加倍数太高，如果与其他日龄列在同一图中，会影响IL-2和IFN-γ的直观比较，故56日龄并没有反映到图4B中，但实际56，90日龄时IFN-γ基因mRNA表达水平高于IL-2近48倍。

由于本试验在所有日龄组鸡的气管中均未检测到IL-2 mRNA的表达，所以无法与IFN-γ基因mRNA表达水平进行比较。

A.肺脏；B.喉图4 不同发育阶段鸡RALT中IL-2和IFN-γ基因mRNA表达水平的比较

3 讨论

目前，大多数关于呼吸道免疫系统的认识都是基于形态学的研究，对其免疫功能的研究在很大程度上也仅限于阐明抗原特异性抗体的反应，而对于正常鸡呼吸道淋巴组织中细胞因子的分泌和表达研究较少。因此，本研究采用实时荧光定量PCR技术，检测不同发育时期鸡呼吸道淋巴组织中Th1细胞因子IL-2和IFN-γ的mRNA表达情况，从分子水平阐述鸡呼吸道淋巴组织免疫功能的建立，从而了解不同时期鸡呼吸道的免疫状态。

IL-2是最重要的细胞因子之一，具有广谱的免疫增强活性，主要由Th1细胞产生，可诱导T、B淋巴细胞的增殖分化，并可促进NK细胞的功能，能抑制Th2型细胞发育，选择性增强Th1型细胞分化增殖，具有显著的抗肿瘤、抗病毒的作用。IFN-γ是由活化的T淋巴细胞和自然杀伤细胞等分泌的一种低分子可溶性糖蛋白[5]。IFN-γ是由活化的NK细胞和T淋巴细胞等分泌的一种低分子可溶性糖蛋白，可以激活血管内皮细胞、NK 细胞和巨噬细胞，能直接作用于T、B淋巴细胞，促进分化。此外，IFN-γ是一种免疫调节的多效性因子，哺乳动物和家禽IFN-γ被用作感染机体的细胞介导免疫的指示器[6]。本研究通过对不同发育时期执行并调节细胞免疫功能的关键细胞因子IL-2和IFN-γ表达水平的检测，发现胚胎时期呼吸道淋巴组织中细胞因子的表达水平极低，即可以认为不表达，但在出壳后随着生长发育，其表达水平逐渐增加，并且在7，14日龄时迅速增加至较高水平，并在21日龄时基本达到峰值，且各时期IFN-γ的表达水平都远高于IL-2，这说明，随着生长发育呼吸道淋巴组织的细胞免疫功能逐渐增强，在出壳初期的1,2周内增加尤为显著，并且在21日龄时基本达到成熟水平，另外IFN-γ将在呼吸道淋巴组织执行细胞免疫功能的过程中发挥主要作用。

CD4+辅助性T细胞主要包括Th1和Th2 2个亚群，Th1细胞对树突状细胞(DC)呈递的抗原和B细胞通过共刺激分子呈递的抗原应答性最好，DC通过分泌IL-12和IL-18刺激Th1细胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α和TNF-β[7]。活化的辅助性T细胞通过免疫突触高度定向地分泌IL-2和IFN-γ。Th1型细胞分泌的细胞因子包括IFN-γ和IL-2等，与CD8+细胞毒性T细胞( CTL) 的增殖、分化和成熟有关，能促进细胞免疫应答，介导迟发型超敏反应，抵抗胞内病原菌和病毒感染[8-10]。本研究对喉、气管和肺脏3种器官中IL-2和IFN-γ mRNA表达水平的比较发现，肺脏的表达水平远高于其他器官。有研究表明肺脏在胚胎期就出现较多抗原呈递细胞-MHC-Ⅱ+细胞[11]，由于表达MHC-Ⅱ+分子的DC细胞能够促进IL-2和IFN-γ的分泌，所以肺脏中有较高水平的IL-2和IFN-γ mRNA表达水平。另外课题组前期研究发现肺脏在35日龄之前T淋巴细胞以CD4+细胞为主，而之后以CD8+细胞为主[12]，这也与本研究所观察到的IL-2和IFN-γ mRNA表达水平逐渐增加相关，即CD4+细胞数量的增加能够分泌更多的IL-2和IFN-γ，而IL-2和IFN-γ又能不断促进CD8+细胞的增殖和分化，因此CD8+细胞逐渐增多，并在35日龄时数目超过CD4+细胞。

综上所述，本研究结果表明随着生长发育RALT的细胞免疫功能逐渐增强，且在21日龄时基本达到成熟水平。另外，各时期IFN-γ的表达水平均远高于IL-2，说明IFN-γ将在呼吸道淋巴组织执行细胞免疫功能的过程中发挥主要作用。