抗登革病毒人源化单克隆抗体h1A1D的构建及纯化

刘宇梦，汪 伟，孙世宇，于 宁，李成辉，庄忻雨，孙文超，鲁会军*，金宁一* (1.广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁530001；.军事科学院 军事医学研究院 军事兽医研究所，吉林 长春1301；3.延边大学 农学院，吉林 延吉 133000；4.温州大学 病毒学研究所，浙江 温州 35035)

登革病毒(dengue virus，DENV)是一种重要的蚊媒传染病病毒，属于黄病毒科黄病毒属，主要的传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊[1]，DENV感染可引起不同程度的临床症状，从无感染症状到有严重的登革出血热和登革休克综合征，并可能导致死亡[2-3],死亡率高达10%[4]。登革热已成为一个全球性的严重公共卫生问题[5-6]。

DENV有4种血清型(DENV1～DENV4)，每种血清型中又有多个基因型[7]，主要以DENV2型流行[8- 9]。DENV为单股正链RNA病毒，含有1个开放阅读框，编码3种结构蛋白(C、pr M和E)和7种非结构蛋白[10]。有研究表明，DENV自然感染过程中诱导的抗体明显以包膜(E)和膜前(pr M)蛋白为靶点[11-12]。研究发现，DENV单克隆抗体h1A1D 能识别ED Ⅲ上的表位，且对4种血清型具有中和活性[13-15]。鼠源性抗体作为异源蛋白应用于人体会引起针对异源蛋白的免疫排斥反应，诱发产生人抗鼠抗体，缩短了抗体在体内的半衰期影响了抗体的治疗效果引起人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody，HAMA)反应[16-17]。人源化单克隆抗体已经成为治疗性抗体药物研究的重要方向，因此，需研发一种具有广谱抗DENV中和活性的单克隆抗体。

本研究参考 GenBank公布的抗体序列，通过基因工程技术将DENV鼠源单克隆抗体轻重链可变区氨基酸序列与人源抗体轻重链恒定区氨基酸序列合成至pcDNA 3.1(+)载体上，转染CHO-K1细胞进行抗体表达，Protein A亲和纯化后，成功制备了抗DENV人源化单克隆抗体h1A1D，本研究结果对进一步探索DENV致病机制及研发登革热的抗体药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器仓鼠卵巢细胞CHO-K1细胞购自中国科学院细胞库；限制性内切酶、质粒提取试剂盒、DL5000 DNA Marker均购自Sigma公司；F-12培养基购自Gibco公司；Protein A亲和纯化介质购自美国GE公司；凝胶成像系统购自PROTEINSIPMLE公司。

1.2 人源化抗体的构建DENV鼠源单克隆抗体m1A1D轻链和重链可变区的氨基酸序列来自 PDB 数据库，PDB：2R69L，2R69H。人源抗体轻链和重链恒定区氨基酸序列根据NCBI上已发表的序列(GenBank登录号：MN200291.1，AY623427.1)。按照图1所设计的抗体结构合成人源化抗体h1A1D基因序列。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

图1 人源化抗体设计图

1.3 人源化抗体h1A1D的真核表达载体的构建将DENV鼠源单克隆抗体m1A1D重链和轻链可变区和人源抗体重链和轻链恒定区合成连接后，再合成至pcDNA3.1(+)载体上。最后得到h1A1D-pcDNA3.1(+)VH/CH、h1A1D-pcDNA3.1(+)VL/CL质粒，克隆至含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，37℃培养10 h；提取重链和轻链表达载体质粒。用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切进行酶切鉴定，酶切鉴定正确后，用质粒大量提取试剂盒提取轻重链质粒后，用微量分光光度计测定其质量浓度，-40℃ 保存。

1.4 人源化单克隆抗体的表达及纯化

1.4.1人源化单克隆的转染及压力筛选 将1×106CHO-K1细胞接种于6孔细胞培养板中，分别将抗体的重链和轻链表达质粒各1 μg和2 μL 转染试剂进行转染，转染72 h后，离心收集培养上清，SDS-PAGE检测抗体是否表达，确定表达后，阳性孔细胞更换含14 g/L G418的选择培养基筛选抗性克隆。

1.4.2抗体的纯化 将具有抗性克隆的培养基，离心取上清，用0.22 μm膜过滤，柱平衡：用10倍体积的PBS( pH 7.5 )清洗Protein A柱。上样：将样品加入上样至柱床，收集液体(此液体简称流穿液)。抗体洗脱：轻轻在柱床上加入洗脱液(20 mm柠檬酸pH 2.7缓冲液)；用中和液(1 mol/L Tris-HCl,pH 9.0)中和，承接时宜多管顺次接取，并记录顺序。洗脱完毕后，用PBS平衡柱子。抗体用PBS(pH 7.2)透析3次，每次4 h以上。透析结束后用0.22 μm膜过滤，分装，-80℃保存。透析后的样品进行SDS-PAGE蛋白电泳分析h1A1D抗体的相对分子质量大小和纯度分析。

1.5 SDS-PAGE蛋白电泳及染色蛋白样品制备：取纯化的洗脱液以及纯化后的抗体，加入蛋白上样缓冲液，还原电泳的样品置于沸水浴10 min；SDS-PAGE蛋白电泳后，考马斯亮蓝快速染色液染色，脱色，完成脱色后观察结果。

1.6 Western blot分析结合活性Western blot分析h1A1D抗体的结合活性，用本实验室构建含有4种血清型DENV ED3蛋白串联基因的4D蛋白Western blot检测其结合活性，以h1A1D 抗体测定其结合。

2 结果

2.1 单抗轻、重链质粒的鉴定对合成的h1A1D-pcDNA3.1(+)VH/CH、h1A1D-pcDNA3.1(+)VL/CL质粒进行双酶切鉴定，获得的重、轻链抗体大小分别约为1 800，900 bp，与预期大小一致(图2)。

M.DL5000 DNA Marker；1.h1A1D重链完整基因片段( Hind Ⅲ/EcoRⅠ)；2.h1A1D轻链基因片段(Hind Ⅲ/EcoRⅠ ) 和pcDNA3.1(+)载体片段( Hind Ⅲ/EcoRⅠ)图2 h1A1D- pcDNA3.1(+)质粒的 Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定结果

2.2 抗体的纯化和表达鉴定将轻、重链表达质粒共转染CHO-K1细胞，经 G418 压力筛选，获得稳定表达人源化h1A1D抗体的细胞系，扩大培养后，进行Protein A 亲和抗体纯化，收集洗脱液进行SDS-PAGE 检测，结果如图3A所示，目的抗体蛋白得到了有效的浓缩和纯化；将纯化后得到的h1A1D抗体分别利用还原胶和非还原胶进行SDS-PAGE电泳分析h1A1D抗体的相对分子质量大小。如图3B、C所示，h1A1D二价抗体的轻、重链大小分别为 30，55 kDa，完整抗体约 190 kDa，与预期大小一致。纯化后抗体的蛋白质量浓度均为1.42 g/L。

A，C.非还原胶SDS-PAGE蛋白质电泳分析；B.还原胶SDS-PAGE蛋白质电泳分析 MW.蛋白 Marker；IN.细胞培养上清；FT.流出液；W.洗脱液；E.洗脱部分图3 Anti-h1A1D纯化结果

2.3 抗体的纯化和表达鉴定首先，抗体含有4种血清型DENV ED3蛋白串联基因的4D蛋白进行Western blot分析，结果显示，1A1D能特异结合抗原(图4)，说明本研究构建的人源化嵌合抗体h1A1D具备了结合活性。

M.蛋白Marker;1.细胞培养上清；2.含有4种血清型的4D蛋白图4 h1A1D抗体特异结合检测

3 讨论

目前DENV感染率和病死率仍在不断增加[16]，每年全球约有4亿人感染DENV，其中约有1亿人出现不同程度的症状[18]。由于尚未发现能够用于临床的针对登革热感染的抗病毒药物，对于该传染病的治疗仅仅是对症治疗。有文献报道针对DENV的特异性抗体的研制已经持续了40 多年，从 20世纪 80 年代开始的鼠源抗体到现在的全人源单克隆抗体[19]，DENV的中和抗体需要足够高效，且最好能同时中和4种血清型的病毒[20]。本研究的目的是为后期获得广谱、高效且特异性好的DENV抗体奠定基础。

目前DENV在同一地区存在不同血清型的交叉感染，因此需要能同时有效中和4种血清型的抗体[21]。而单克隆抗体 1A1D 识别 EDⅢ上的表位，通过抑制病毒同细胞表面受体的结合而预防感染，对 DENV1-3都具有中和保护活性。因此本试验所设计的h1A1D单克隆抗体目的在于通过基因工程技术来对人源的单克隆抗体和鼠源的单克隆抗体进行改造，获得人源化的单克隆抗体，Western blot结果显示，h1A1D能特异结合抗原，说明本研究构建的人源化嵌合抗体h1A1D具备了结合活性。

本试验选择pcDNA3.1真核表达载体构建h1A1D-pcDNA3.1(+)重组表达载体，这与原核表达载体相比，虽然不能一次性获得大量的蛋白，但是真核细胞中表达蛋白具有高活性。本研究旨在获得纯化的h1A1D，采用protein A亲和层析纯化方法，此操作简单、简易、有效，整个纯化过程操作时间短，较高程度的降低了蛋白降解的可能性，较好的保持了蛋白本身的活性。

本研究将登革鼠源抗体h1A1D重、轻链可变区氨基酸序列与人源抗体重链和轻链恒定区氨基酸序列合成到pcDNA3.1(+)真核表达载体，转染CHO-K1细胞进行抗体表达，亲和纯化后，成功制备了抗DENV人源化单克隆抗体h1A1D。