TRAIL单核苷酸多态性及血清sTRAIL与食管癌的关系研究*

闫晓华，刘瑞磊，高秀展，彭宝相，程振娜，徐 燕,张纪云

1.山东医学高等专科学校医学检验系，山东临沂 276000；2.临沂市人民医院妇产科,山东临沂 276000；3.临沂市肿瘤医院检验科，山东临沂 276000

流行病学调查显示，食管癌占所有恶性肿瘤的2%，病死率在全部恶性肿瘤中居第6位[1],我国是世界上食管癌高发的地区，其病死率居世界首位[2]。有研究表明，食管癌的发生与环境、生物、遗传等均有关系[3]。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族成员，其可选择性诱导肿瘤细胞、病毒感染细胞等发生凋亡，而对正常细胞无影响[4],正是由于此特性，其与肿瘤发生的关系引起研究者的关注。本研究旨在探讨TRAIL基因及其血清水平与食管癌发生、发展的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年5月至2020年5月在临沂市人民医院、临沂市肿瘤医院就诊及住院的食管癌(鳞癌)患者157例作为食管癌组。其中男101例，女56例，年龄(48.2±8.5)岁。纳入标准：(1)未经放疗和化疗；(2)原发性食管癌；(3)未合并心、肺、肝、脑、肾等疾病。对照组为同期体检健康者150例，男98例，女52例，年龄(46.7±6.1)岁。两组年龄、性别等比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所有研究对象间无血缘关系，且签署知情同意书，本研究符合医学伦理学原则。

1.2仪器与试剂 全血基因组DNA提取试剂盒(Tiangen 公司)、PCR试剂(Tiangen 公司)、限制性内切酶(Tas Ⅰ及Rsa Ⅰ，Fermentas公司)、紫外显像系统(BIO-RAD Gel Doc XR)、核酸蛋白测定仪(Eppendorf BioPhotometer D30)、基因扩增仪(Biometra T1)、酶标仪(BIO-RAD Model 680)、稳压稳流电泳仪(北京市六一生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集 所有研究对象空腹采血4 mL，其中乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血2 mL,-18 ℃保存；肝素抗凝血2 mL，2 570×g离心10 min，取血清,于-18 ℃保存。

1.3.2基因组DNA的提取 按照试剂盒说明提取EDTA抗凝全血基因组DNA，产物通过核酸蛋白检测仪和琼脂糖凝胶电泳进行验证。

1.3.3PCR扩增目的基因片段 TRAIL基因引物由上海博亚公司合成，引物序列：上游引物为5′-AACATCTTCT-GTCTTTATAATC-3′,下游引物为5′-AAATAACACGTACTTACTGAAG-3′。扩增片段长度为484 bp，包含1525G/A、1588G/A、1595C/T 3个多态性位点，反应体系共50 μL。各取5 μL PCR产物用2.0 g/L琼脂糖凝胶(溴化乙锭10 μg/mL)电泳，采用紫外显像系统观察DNA条带。

1.3.4等位基因及基因型分析 (1)基因测序。由于1588位点的限制性内切酶无法获得，所有PCR扩增产物由上海生工生物工程有限公司测序。(2)PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)法分析：随机抽取30份PCR产物用限制性内切酶进行酶切分析，并与测序结果比对。用Rsa Ⅰ酶切1525位点，Tas Ⅰ酶切1595位点，酶切产物均用2.5 g/L琼脂糖凝胶电泳验证，电泳结果用紫外显像系统分析。

1.3.5血清sTRAIL水平检测 使用人TRAIL定量酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)检测所有标本血清sTRAIL水平。

2 结 果

2.1Hardy-Weinberg平衡定律检验 TRAIL基因1525G/A、1588G/A、1595C/T位点等位基因型的理论分布频率采用直接计算法，经χ2检验，期望值与观察值差异无统计学意义(χ2=0.669,P=0.716)，达到遗传平衡，说明所选研究对象具备群体代表性。

2.2单核苷酸多态性(SNPs)分析 根据测序结果分析PCR产物 SNPs，并随机抽取30例PCR产物使用限制性内切酶酶切验证测序结果。TRAIL基因 1525G/A位点经Rsa Ⅰ 酶切，获得产物经琼脂糖凝胶电泳，可形成GG基因型(473、11 bp)、GA基因型(473、286、187、11 bp)和 AA基因型(286、187、11 bp)3种电泳条带，见图1。TRAIL基因 1595C/T位点经 Tas Ⅰ酶切，获得产物电泳可出现 CC基因型(291、193 bp)、CT基因型(291、193、131、62 bp)和 TT基因型(291、131、62 bp)3种电泳条带，见图2。所选标本酶切结果与测序结果一致，同时发现食管癌组与对照组 1525G/A、1588G/A和1595C/T位点SNPs呈完全连锁，为一个单体型。

2.3两组基因型与等位基因频率比较 食管癌组TRAIL第5外显子的3′非翻译区(3′UTR)1525、1588、1595位点基因型和等位基因频率与对照组比较，1525G/A、1588G/A、1595C/T基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)；食管癌组1525G、1588G、1595C等位基因频率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组基因型与等位基因频率比较[n(%)]

2.4根据食管癌患者病理组织学特征TRAIL SNPs分析 食管癌组TNM分期Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期1525G/A、1588G/A及1595C/T位点基因型分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)；不同细胞分化程度1525G/A、1588G/A、1595C/T位点基因型分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 食管癌组患者不同TNM 分期及细胞分化程度TRAIL 基因型分析(n)

注：1为GG基因型；2为GA基因型；3为AA基因型;4为PCR产物；5为2 000 bp DNA Marker。

2.5各组血清sTRAIL水平比较 食管癌组血清sTRAIL水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；食管癌组TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期血清sTRAIL水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；不同细胞分化程度sTRAIL水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；食管癌组不同基因型血清sTRAIL水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

注：1为CC基因型；2为CT基因型；3为TT基因型;4为PCR产物；5为2 000 bp DNA Marker。

表3 各组血清sTRAIL水平比较

续表3 各组血清sTRAIL水平比较

3 讨 论

TRAIL为肿瘤坏死因子超家族成员，是从人心肌的cDNA文库中克隆出来的，人类TRAIL基因定位于3号染色体长臂2区6带(3q26)[4]。肿瘤坏死因子是一类具有多种生物学活性的非种属特异性细胞因子，TRAIL可通过激活凋亡途径参与机体免疫功能调节，在肿瘤发生、转移及自身免疫性疾病等病理过程中发挥重要作用[5-6]。TRAIL有5种受体，分别称为TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、TRAIL-R3(DcR1)、TRAIL-R4(DcR2)、TRAIL-R5(OPG)，前4种受体为细胞膜结合受体，OPG为细胞外分泌性受体。DR4和DR5的细胞质区含有死亡结构域，能传递死亡信号，诱导细胞凋亡。DcR1、DcR2为膜诱骗受体，OPG是一种可溶性诱骗受体，这3种受体没有功能性的死亡结构域，不诱导细胞凋亡[7]。TRAIL与TRAIL受体存在于人体多种组织，TRAIL是否诱导细胞凋亡取决于不同途径介导与何种受体的结合。细胞凋亡是维持机体组织内环境稳定的一个重要过程，在肿瘤发生机制中起一定作用[5-8]。近年来，TRAIL与食管癌的研究取得了很大进展,包括TRAIL诱导[9]、TRAIL联合药物诱导食管癌细胞凋亡的研究[10-11]。有关食管癌遗传易感性的研究也有很多,如XPA、GSTP1、转化生长因子β1、环氧合酶-2、醇脱氢酶-2、Fas/FasL等基因与食管癌的相关性研究[12-16]。

本研究结果显示，TRAIL基因的第5个外显子3′UTR 1525G/A、1588G/A、1595C/T位点 SNPs分析，测序结果与PCR-RFLP结果一致。本研究结果发现，食管癌组TRAIL基因第5外显子3′UTR 1525G/A、1588G/A、1595C/T基因型分布与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；食管癌组1525G/1588G/1595C等位基因频率明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；TRAIL基因3′UTR携带1525G/1588G/1595C基因时，TRAIL蛋白表达量下降，或者由此基因调控生成的TRAIL蛋白与受体DR4、DR5结合诱导肿瘤细胞凋亡的能力下降，从而导致肿瘤发生率升高。本研究结果还显示，食管癌组血清sTRAIL水平明显低于对照组，食管癌组按照基因型分组1525GG/1588GG/1595CC 血清sTRAIL水平低于1525AA/1588AA/1595TT水平，这与任秀花等[17]报道的食管浸润癌组织TRAIL蛋白呈低表达的结论一致。有研究显示，食管癌组根据肿瘤TNM分期，Ⅲ～Ⅳ期血清sTRAIL水平明显低于Ⅰ～Ⅱ期血清sTRAIL水平，此结果提示血清sTRAIL水平与食管癌的进展与预后是有关系的。通过对所选标本基因型分析，笔者发现TRAIL基因(1525G/A、1588G/A、1595C/T)呈完全连锁遗传，这与本课题组前期的研究结果一致[5]，也与蒋益等[18]的研究结果一致。本研究显示，食管癌组患者不同TNM分期TRAIL基因型分布及血清sTRAIL水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；食管癌组患者不同细胞分化程度TRAIL基因型分布及等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)，此结论与本研究预先推测结论有一定差异，这可能与本研究样本量较小及地域限制有关，需要后期扩大地域范围、补充样本量继续分析。

综上所述，TRAIL与食管癌的发生、发展有一定相关性。中国人TRAIL基因的第5外显子3′UTR存在食管癌的易感基因型，食管癌患者血清sTRAIL表达水平较健康人降低Ⅲ～Ⅳ期患者血清sTRAIL水平明显低于Ⅰ～Ⅱ期。