生长分化因子11对高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞凋亡的影响

游 艳，田萧羽，曾 浪，党瑞杰，曾邦兵，朱 彪，李云霞

与非糖尿病患者相比，糖尿病患者的甲状腺癌发生率更高[1, 2]。高血糖是甲状腺癌发生、发展的一个独立危险因素[3]，有研究发现，高血糖能够促进人甲状腺乳头状癌K1细胞的增殖并抑制其凋亡[4,5]。生长分化因子11(growth differentiation factor 11, GDF11)是近年来发现的一种具有“返老还童”作用的生长因子，它能改善2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗，改善胰岛β细胞功能、增加β细胞数量并缓解糖尿病的大血管病变及微血管病变等并发症[6-8]。但是，GDF11对高糖环境下甲状腺癌的作用尚不清楚。细胞凋亡过低可导致肿瘤的发生，而诱导细胞凋亡是肿瘤治疗的一种有效手段[9]。因此，本研究以在高糖环境中培养的人甲状腺乳头状癌K1细胞为研究对象，初步探讨GDF11对高糖环境下人甲状腺乳头状癌K1细胞凋亡的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂与仪器 人甲状腺乳头状癌K1细胞株(武汉巴菲尔生物科技有限公司)，重组人GDF11蛋白(北京百奥莱博公司)，葡萄糖(美国Sigma公司)，低糖DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)，胰酶、青霉素及链霉素(美国Sigma公司)，B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)抗体(货号：AF6139，稀释比例:1∶1000；美国Affinity公司)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein, Bax)抗体(货号：Ab32503，稀释比例:1∶3000；英国Abcam公司)、β-actin 抗体(货号：BM0627，稀释比例为1∶200；武汉博士德公司)及山羊抗兔二抗(美国Cell Signaling Technology公司)；活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒及反转录试剂盒(南京建成科技有限公司)；BCA(bicinchoninic acid)测定试剂盒(武汉博士德公司)；Trizol试剂盒(北京艾德莱生物公司)；PVDF(polyvinylidene fluoride)膜(美国Millipore公司)。

SW-CJ-1FD型二氧化碳恒温培养箱(苏州集团安泰空气技术有限公司)，FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)，SpectraMax Gemini型荧光酶标仪(上海美谷分子仪器)，BCM-1000A型生物净化工作台(苏州安泰)，5702R型低速离心机、Biophotometer核酸蛋白测定仪(德国艾本德公司)，DYY-7C型电泳仪、DYCZ-40型转膜仪(北京六一仪器厂)，LW300LFT型正置荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.2 细胞分组 K1细胞采用含10%胎牛血清的低糖DMEM(培养基中葡萄糖含量为5.6 mmol/L)培养液培养。实验分为：对照组(Vehicle)采用低糖DMEM培养液培养；高糖组(high glucose, HG)将低糖DMEM培养液中的葡萄糖含量提高到33 mmol/L; GDF11干预组(GDF11)HG+30 g/ml GDF11[10]。各组K1细胞加药后继续培养3 d进行后续实验(培养期间不换液)。

1.3 细胞凋亡率 取各组细胞，采用0.25%不含EDTA的胰蛋白酶消化后，1500 r/min离心5 min，PBS重悬细胞制成单细胞悬液备用。加入Annexin V-FITC和PI，分别混匀，于室温下避光孵育10～15 min后，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。采用FlowJo 10.4软件对流式数据进行分析：左上象限(Q1)代表细胞死亡比例，右上象限(Q2)代表晚期凋亡比例，右下象限(Q3)代表早期凋亡比例，左下象限(Q4)为活细胞比例，细胞凋亡率= Q2+Q3。

1.4 Western blot检测凋亡相关蛋白的表达 取各组细胞，PBS缓冲液冲洗3遍后加入细胞裂解液裂解细胞并提取总蛋白。BCA定量试剂盒测定总蛋白浓度后，各取40 μg总蛋白，加入5倍上样缓冲液，于100 ℃水浴10 min 使蛋白变性。凝胶电泳分离蛋白、转膜、室温封闭后分别滴加特异性一抗封闭过夜，再以辣根过氧化物酶标记的二抗振荡封闭2 h。最后，用化学发光剂染色、显影并采用Band Scan软件分析胶片灰度。

1.5 实时荧光定量逆转录PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测核转录因子E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor, Nrf2)的转录表达 取各组细胞，Trizol试剂盒提取总RNA。然后将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增。扩增的条件为：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；70 ℃，45 s。扩增40个循环。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 细胞中ROS检测 取各组细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，1500 r/min离心10 min，PBS重悬细胞制成单细胞悬液。按试剂盒说明加液，酶标仪检测细胞内ROS水平。

2 结 果

2.1 GDF11对高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞凋亡的影响 与Vehicle组相比，高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞的凋亡率降低(P<0.05)，GDF11干预升高了高糖环境中人甲状腺乳头状瘤K1细胞的凋亡率(P<0.05，图1，表2)。

图1 各组甲状腺乳头状癌K1细胞凋亡率

表2 各组甲状腺乳头状癌K1细胞凋亡率、相关蛋白的表达、GDF11对Nrf2转录及K1细胞中ROS水平的影响

2.2 GDF11对高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞凋亡相关蛋白表达的影响 与Vehicle组相比，高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax的表达比升高(P<0.05)，GDF11干预降低Bcl-2与Bax表达比(P<0.05，图2，表2)。

图2 各组甲状腺乳头状癌K1细胞凋亡相关蛋白的表达

2.3 GDF11对高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞Nrf2转录表达的影响 与Vehicle组相比，高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞Nrf2的转录表达水平升高，差异有统计学意义，GDF11干预降低高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞Nrf2的转录表达(P<0.05，表2)。

2.4 GDF11对高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞ROS水平的影响 与Vehicle组相比，高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞的ROS水平明显降低，差异有统计学意义(P< 0.05)，而GDF11干预显著升高高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞的ROS水平(P<0.05，表2)。

3 讨 论

本研究以在高糖环境中培养的人甲状腺乳头状癌K1细胞为研究对象，发现GDF11能提高K1细胞的凋亡率，降低抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax的蛋白表达比，下调Nrf2基因的转录表达并提高K1细胞内的ROS水平。

氧化应激是由细胞内过量的ROS和氧化自由基引起的，而Nrf2是体内调控氧化应激反应的重要核转录因子[11]。细胞内的氧化应激反应刺激Nrf2的转录表达与核转位，进而增加抗氧化物酶和II相解毒酶的表达，从而发挥抗氧化应激和抑制肿瘤发生的作用[12]。但是，持续过度的Nrf2激活可促进胰腺癌、肺癌和直肠癌等多种肿瘤的发生[13]。甲状腺癌的体外研究也表明，上调Nrf2的转录表达显著抑制多种类型甲状腺癌细胞的凋亡[14]，反过来，下调Nrf2的转录表达则促进甲状腺乳头状癌细胞凋亡[15]。本研究发现，高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞内Nrf2的转录表达明显升高，细胞凋亡率下降，这与临床研究中发现人甲状腺乳头状瘤组织中出现Nrf2高表达的实验结果一致[16]。而GDF11干预能显著下调Nrf2的转录表达，进而提高K1细胞内ROS的水平，即加重了细胞内的氧化应激反应。

细胞凋亡是机体维持自稳的一种生理机制，在肿瘤发生、发展的进程中也占有重要的地位。细胞凋亡是在特定的凋亡信号刺激下，细胞发生主动死亡的过程[17]，氧化应激是诱导细胞发生凋亡的一个重要刺激因素。有研究发现，细胞内ROS的聚集可通过降低线粒体膜电位并改变细胞内钙离子的浓度来促进人甲状腺乳头状癌K1细胞凋亡[9]。本实验也发现，GDF11干预可升高K1细胞内被高糖刺激所降低的ROS水平并提高K1细胞凋亡率。

Bcl-2是bcl-2家族的重要成员，通过阻止线粒体内细胞色素C的释放来抑制细胞凋亡，而Bax可与线粒体膜上的通道蛋白结合，通过促进细胞色素C的释放诱导细胞凋亡[18]。本研究通过流式细胞术分析发现，GDF11干预提高高糖环境中K1细胞凋亡率。同时，采用western blot技术检测K1细胞内Bcl-2和Bax的蛋白表达情况，结果发现，GDF11干预能够降低Bcl-2与Bax的蛋白表达比，这从另一个方面佐证了GDF11干预可以促进高糖环境中K1细胞凋亡。而Bcl-2蛋白的表达也受Nrf2的调控[19, 20]，Nrf2在GDF11干预降低高糖环境中K1细胞Bcl-2表达中的作用值得进一步探讨。

综上所述，本研究发现GDF11可在体外促进高糖环境中人甲状腺乳头状癌K1细胞凋亡，GDF11有望被开发成一种治疗糖尿病伴发甲状腺乳头状癌的新型药物。