β-catenin与Lgr5在胃癌进程中的表达及其意义

郑艳敏，刘积平，周小嫔，赵红艳，于美娜，牛海艳

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率在全世界居第4位，死亡率排在第2位，转移率和复发率高[1]。目前，尚缺乏治疗胃癌的靶向药物和个性化治疗方案。因此，深入研究胃癌发生发展的分子机制，早期诊断和治疗对胃癌患者预后和提高其存活率具有重要意义。

Wnt信号途径是调节细胞增殖、分化、运动及凋亡的重要信号传导系统。研究证实Wnt基因异常/异位表达与多种肿瘤的发生发展密切相关，参与了细胞分化、极性形成、增殖和迁移过程[2]。β-连锁蛋白(β-catenin)是经典Wnt信号传导通路的核心，是该信号通路激活的标志，其高表达与多种肿瘤的不良预后相关[3]。富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(Lgr5)是Wnt/β-catenin信号通路的靶基因，在人类不同肿瘤过表达，包括乳腺癌、直肠癌、前列腺癌[4-6]等。前期研究中，我们通过构建慢性浅表性胃炎模型检测Lgr5的表达情况，结果表明，持续的炎性刺激可导致Lgr5表达增加，Lgr5可能是一种炎性的促肿瘤因子[7]。目前，β-catenin和Lgr5在胃癌中的表达及意义可见相关报道，但关于Wnt信号通路相关靶基因在从胃炎进展到胃癌前病变，再到胃癌过程中是否处于失调状态则少见报道。本研究中我们采用免疫组织化学方法检测慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胃癌及正常组织中β-catenin及Lgr5的表达，探索Wnt信号通路靶基因在胃炎到胃癌演变过程中的作用，为胃癌的诊断、防治和判断预后提供新思路。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2014-03至2015-06在武警特色医学中心住院及门诊病例105例，其中正常胃黏膜23例，慢性浅表性胃炎25例，慢性萎缩性胃炎27例，胃癌30例。其中男55例，女50例，年龄24～70岁。所有标本用10%多聚甲醛溶液固定过夜，石蜡包埋，制成5 μm切片。

1.2 试剂和抗体 β-catenin抗体(中国博奥森公司)，工作浓度为1∶150。Lgr5抗体(Epitomics)，工作浓度为1∶200。

1.3 HE染色 活检的胃组织石蜡包埋，切片放在60 ℃烘箱中烘烤30 min，常规脱蜡，流水冲洗10 min后，苏木精染色3 min。随后用流水冲洗10 min，伊红复染2 min，流水冲洗10 min，75%乙醇脱水，二甲苯两次透明，中性树胶封固。每张切片在200倍显微镜下随机选择5个视野进行观察。

1.4 免疫组织化学染色 应用兔超敏二步法免疫组化试剂盒行免疫组化染色，胃镜活检的胃组织切片用3%的H2O2封闭10 min后，用pH=6.0的枸橼酸溶液加热孵育15 min行抗原修复。冷却至室温后用5%的山羊血清37 ℃封闭30 min。分别滴加β-catenin及Lgr5一抗4 ℃过夜。PBS清洗后滴加二抗，37 ℃孵育45 min。PBS清洗后DAB显色剂显色，冲洗，苏木精复染，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。在Nikon偏振光倒置显微镜下观察免疫阳性反应物的分布与定位。随机选取5个不重复视野，镜下计数形态完整的β-catenin及Lgr5阳性细胞，计算各组的平均阳性细胞数。用抗体稀释液代替一抗做阴性对照，每组设置相应的阳性对照。

1.5 结果判断 细胞膜、细胞核或细胞质内见均匀一致的棕色颗粒定义为染色阳性。于200倍镜下随机选取5个视野根据阳性细胞比例和染色强度分别行半定量评分。结果取均值。阳性细胞比例≤10%、11%～30%、31%～60%、61%～100%分别计0～3分。染色强度按无、弱(浅棕色)、中(棕色)、强(深棕色)分别记0～3分(相应染色强度的细胞比例必须>10%)。总分为两项计分之和，两项计分均≥1分判断为表达阳性[8]。

1.6 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行分析。计数资料采用绝对数和率表达，β-catenin和Lgr5在正常胃黏膜及不同胃病变组织中阳性表达率比较行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HE染色结果 正常胃黏膜中正常腺胃组织，未见异常改变；慢性浅表性胃炎组织中黏膜固有膜、黏膜肌及黏膜下炎细胞浸润；萎缩性胃炎组织中腺体减少，炎性细胞浸润；胃癌组织中大量纤维化，腺体呈不规则分布，细胞核分裂象增多(图1)。

图1 不同胃组织病理改变(HE，×200)

2.2 β-catenin在正常胃黏膜及不同胃黏膜病变组织中的表达 β-catenin在正常胃黏膜少量表达，主要在胞膜上表达，阳性表达率为8.7%，在慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎及胃癌中胞膜和胞浆均表达，阳性表达率依次增高，分别为28.0%、59.3%、83.3%，β-catenin在正常胃黏膜与不同胃黏膜病变组织中阳性表达率存在统计学差异(P<0.05，图2，表1)。

图2 β-catenin蛋白在不同胃组织中的表达(免疫组织化学染色，×200)

2.3 Lgr5在正常胃黏膜及不同胃黏膜病变组织中的表达 Lgr5在正常胃黏膜少量表达或不表达，主要为膜表达，阳性表达率为13.0%。在慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎及胃癌中胞膜和胞浆均表达，阳性表达率依次增高，分别为32.0%、66.7%、86.7%，Lgr5在正常胃黏膜与不同胃黏膜病变组织中阳性表达率存在统计学差异(P<0.05，图3，表1)。

图3 Lgr5蛋白在不同胃组织中的表达(免疫组织化学染色，×200)

表1 β-catenin和Lgr5在不同胃黏膜组织中的表达情况(n；%)

3 讨 论

胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率高，其发病机制目前尚未完全明确，多条信号通路异常活化在其发生、发展过程中发挥关键作用。Wnt信号通路是调节细胞增殖、凋亡、分化、迁移等生物过程的重要信号传导通路之一，在机体生长发育过程中发挥作用。Wnt信号通路分为两类：Wnt1类和 Wnt5a类，前者包括Wnt1，Wnt3a等，主要激活经典Wnt/β-catenin信号通路[9]，后者包括Wnt5a，Wnt11等，主要激活非经典Wnt信号通路(包括Wnt/JNK通路和Wnt/Ca2+通路[10])。

β-catenin是一种重要的黏附因子，广泛存在于各种细胞中，是Wnt信号通路的关键因子，其主要表达于细胞膜中，少量表达于细胞质，与细胞的增殖、凋亡、转移等生理过程密切相关。正常细胞中没有Wnt/β-catenin信号通路，因为胞质中的β-catenin通过泛素化与蛋白酶体途径降解。Wnt/β-catenin信号通路激活过程是Wnt配体与低密度脂蛋白(lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP-5/6)受体或卷曲蛋白(frizzled，FZD)受体结合导致蓬松蛋白(dishevelled，DVL)磷酸化、多聚泛素化，从而抑制由轴蛋白(Axin)、肠腺瘤样息肉蛋白(APC)和糖原合成激酶GSK-3β组成的复合物的活性，使β-catenin不能被GSK-3β磷酸化，导致β-catenin在胞浆内积聚并移向核内，与T细胞转录因子/淋巴样增强因子结合调节下游靶基因表达，如细胞周期素D1(cyclinD1)，基质金属蛋白酶-7(MMP-7)、C-myc等[11]。越来越多的研究证实，通路中各因子的不恰当激活如Wnt1高表达和β-catenin膜表达缺失或核异位表达等均可导致Wnt通路异常激活，使肿瘤细胞的粘连性下降，最终导致侵袭性生长和转移，与多种肿瘤的发生发展有关[12, 13]。

Lgr5又名GPR49，是具有18个富含亮氨酸的重复单位和7个跨膜区域组成的大分子蛋白，属于G蛋白偶联受体家族成员，同时也是Wnt信号通路下游的靶基因，广泛分布于胃、肾、肝脏、卵巢等体内多种组织和器官[14, 15]。正常情况下，Lgr5只在成人干细胞表面呈低水平表达，多位于隐窝基底部[16]。近年来研究发现Lgr5在食管癌、结直肠癌、肝癌等多种肿瘤中过度表达[17]，参与肿瘤干细胞异常增殖分化过程。高国安和高超[18]研究表明，Lgr5在胃癌组织中的阳性率显著高于癌旁组织，且与肿瘤大小、分化程度、TNM分期和淋巴结转移明显相关。李京伟等[19]通过qRT-PCR和western bolt方法分别检测不同分化程度的胃癌组织样本和胃癌细胞株Lgr5、β-catenin、c-Myc和MMP-7表达情况，结果显示，在胃癌临床样本和胃癌细胞株中 Lgr5、β-catenin、c-Myc和MMP-7表达水平随着胃癌分化程度升高而升高，说明Lgr5与β-catenin通路的异常激活可能促进胃癌的恶化。因此，Wnt通路异常激活引起靶基因Lgr5表达增高，可能与细胞的增殖分化和恶性转化密切相关，在肿瘤的发生、发展中发挥关键作用。

在本研究中，β-catenin在正常胃黏膜中属于膜表达，在慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎和胃癌中的表达依次递增，尤其在胃癌中是强表达，并且属于胞膜、胞浆均表达。这与Mao等[20]在细胞水平上检测的结果基本相似。他通过往胃癌细胞转入Wnt1，证实Wnt1促进胃癌细胞增殖，通过蛋白和基因水平方面证实Wnt1以及β-catenin表达量相对增高，同时他还转入siRNA干扰Wnt1发现胃癌细胞中Wnt1及β-catenin表达相对其他对照组减少。Lgr5在正常胃黏膜、慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎以及胃癌中的表达也是呈现逐级递增。在本研究中显示有部分慢性浅表性胃炎组织β-catenin、Lgr5表达就已经开始增高，所以推测Wnt通路在早期就已经激活，在持续的炎性刺激下促进靶基因β-catenin、Lgr5表达增加，从而影响胃癌的发生和发展。由此推测lgr5、β-catenin可能是胃癌的癌干细胞标记物，是判断胃癌前病变Wnt/β-catenin信号通路异常活化的重要标志物。从浅表性胃炎、萎缩性胃炎到胃癌发生发展过程中Wnt/β-catenin通路处于激活状态，其异常活化与胃癌的发生、发展和预后密切相关。本研究为胃癌发病机制的研究、靶向药物治疗和预后评估提供新思路和理论依据，具有广泛的临床应用前景。

由于Wnt信号转导通路除了Wnt/β-catenin通路外，还有Wnt/Ca2+信号通路及c-Jun N端激酶介导的细胞极性信号转导通路，具体发病机制还有待于我们进行更深入的研究。