血清外泌体LncRNA NEAT1在非酒精性脂肪性肝病肝纤维化中的诊断价值*

王 艳 邓卫平 李瑞明

1.中山市博爱医院消化内科 (广东 中山， 8306123) 2.湖北医药学院附属太和医院消化内科

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是我国最常见的慢性肝病，而肝纤维化的发展和进展是NAFLD患者预后最重要的预测因素[1]。因此，早期识别肝纤维化变得越来越重要。目前关于NAFLD生物标记物的研究主要集中于以下三类：①诊断标记物，用于反映目前的纤维化阶段；②预后标记物，根据纤维化进展风险对个体进行分层，并用于预测患者预后；③监测标记物，可用于跟踪疾病进展或治疗反应。但是目前临床上常用的血清学标志物，例如肝功能指标、肝纤维化指标等[2]，都具有一定的滞后性和非特异性，这些指标的波动可能受到共病条件的影响，因此需要对结果进行严格的解释。越来越多的证据表明，长链非编码RNA(LncRNA)作为一种相对稳定的遗传标记，在肝纤维化鉴别诊断中发挥着作用要作用[3]。尤其是血浆外泌体中的LncRNA结构稳定，适用于常规检测。但是目前外泌体LncRNA检测仍然处于实验性阶段，需要大量临床样本进一步验证。近几年，越来越多的基础研究证实，核富集转录体1(NEAT1)是肝纤维化过程中的关键分子[4]。然而少有临床研究的证据支持。因此本研究通过对183例在我院就诊的非酒精性脂肪肝炎(NASH)患者的血液样本进行实时荧光定量PCR法检测，分析不同临床特征的患者之间血清外泌体LncRAN NEAT1水平的差异，以及该指标在肝纤维化监测中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2015年1月～2018年12月期间就诊的183例NASH患者的病历资料和血液样本，包括90例未发生纤维化患者(男性55例，女性35例)，年龄21～76岁，平均(43.66±14.19)岁和93例纤维化患者(男性58例，女性35例)，年龄19～78岁，平均(44.97±12.60)岁。所有的研究参与者都接受了病史、体格检查、人体测量和实验室检查。另外选择50例和NASH患者性别、年龄相匹配的健康志愿者作为正常对照组(男性32例，女性18例，年龄20～73岁，平均年龄45.48±13.50岁)。正常对照组人群肝功能检测、肝脏超声检查结果均正常。本研究经由我院医学伦理委员会审核备案，且完全符合赫尔新基宣言。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①根据饮酒史、临床表现、实验室检测、典型的影像学(US、CT、MRI)检查确诊为NASH，符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南》[5]中关于NASH的诊断标准；②在超声引导下经肝组织穿刺活检判断患者是否发生肝纤维化。排除标准：①排除晚期肝硬化者(Child-Turcotte-Pugh B或C级)、病毒性或自身免疫性肝炎性疾病、大量饮酒史(女性>20 g/d，男性>30 g/d)、使用脂肪性药物或与肝脏脂肪堆积有关的遗传性疾病；②有肝移植手术史、肾功能受损、缺血性心脏或脑血管疾病或恶性肿瘤患者。

1.3 研究方法

1.3.1 检测指标 ①体重指数(BMI)、全血计数[淋巴细胞百分比(LYM%)、中性粒细胞百分比(NEU%)、血红蛋白(Hb)和血小板(PLT)，计算中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)及血小板/淋巴细胞比值(PLR)、肝功能指标[包括血清总胆红素(TBil)、血清白蛋白(Alb)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)、血清总蛋白(TP)、空腹血糖(FBG)、血脂代谢指标[高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、血清总胆固醇(TC)。②采用稳态模式评估法(HOMA-IR)评估胰岛素抵抗指数(IR)= FBG×FINS/22.5。所有的生化指标在采集血样后2 h内检测完毕,并在多道自动分析仪(日本Hitachi公司)上测量。③通过酶联免疫吸附试验检测血清细胞角蛋白18(CK-18)。④采用放射免疫法试剂盒检测血清肝纤维化指标[Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)]。⑤根据活检组织(至少需要15 mm长的活检标本或至少10个完整的门静脉束的存在)中含有脂滴的肝细胞百分比(≥5%)评估脂肪变性，采用欧洲脂肪肝协作组提出的肝组织脂肪变性、炎症活动度及纤维化(SAF)评分标准进行评估[6]：F1，窦周或门静脉周围纤维化；F2，无桥接的窦周和门静脉周围纤维化；F3，桥接纤维化；F4，肝硬化。F1～F2期为轻中度期，F3～F4期为进展期。

1.3.2 提取血清外泌体并采用qRT-PCR法检测LncRNA NEAT1相对表达量 取500 μl血清加入126 μl外泌体快速沉淀液(美国System Biosciences公司)，4℃条件下放置30 min，3 000 r/min离心30 min，弃上清，留取沉淀，得到外泌体。外泌体样本鉴定：采用免疫印迹(Western Blot)法检测外泌体标志性蛋白CD9、CD63、TSG101的阳性表达情况以及Calnexin蛋白的阴性表达情况。透射电镜下观察外泌体形态特征，采用NanoSight LM10颗粒跟踪系统(美国Malvern公司)对外泌体粒径进行分析和校准。

1.3.3 qRT-PCR法检测外泌体LncRNA NEAT1相对表达量利用Trizol试剂(美国invitrogen公司)从外泌体样本中提取总RNA。取0.5～1 μg的RNA作为逆转录模板，采用RNAspin Mini Isolation Kit(美国Applied Biosystem公司)采用随机引物进行RT反应。采用NCBI BLAST设计NEAT1引物：正向5′-GGC AGG TCT AGT TTG GGC AT-3′，反向5′-CCT CAT CCC TCC CAG TAC C-3′。用SYBR Green Mix试剂盒(GoTaq®qPCR Master Mix；美国Promega公司)配制25 μl PCR反应体系。采用One-step 实时PCR系统(美国Applied biosystem系统)在48孔板上进行qRT-PCR。参数设置：第一步1个循环，95℃ 2 min；第二步40个循环，95℃ 15 s，58℃ 40 s；第三步，95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s收集荧光信号。对每个样本单独重复3次实验。选择β-actin作为内参：正向5’-ATC AAG ATT CTC TCT CTC TGA-3’；反向5’-CTG CTT GCT GAT CCC TCC TCC TG-3’。通过计算公式(2-ΔΔCt)得到NEAT1表达的相对倍数变化。

2 结果

2.1 基线资料 见表1。与正常对照组相比，肝纤维化组和非肝纤维化组NASH患者BMI、PLT、糖尿病史比例、ALT、AST、GGT、FBG、HOMA-IR、TG、LDL-C、CK-18、PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平升高，同时PLT、ALB水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而且与非肝纤维化组患者人群相比，肝纤维化组患者GGT、CK-18、PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平进一步升高，同时PLT水平亦进一步降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 基线资料在各组人群的组间对比

2.2 血清外泌体的提取和鉴定 经试剂盒提取得到外泌体样本后，采用透射电镜和Western Blot法鉴定，外泌体呈典型的圆形或杯状形态，直径约50～150 nm，肝纤维化组和非肝纤维化组NASH患者血清外泌体粒径略大于正常对照组人群[(118.5±3.7)nm vs(100.2±2.6)nm vs(65.0±2.3)nm]。经Western Blot条带图显示，外泌体标记物包括蛋白CD63和TSG101在呈高表达。以calnexin蛋白作为阴性对照，已证实外泌体中无此蛋白，但上清样本中有此蛋白(见图1)。

图1 透射电镜、纳米颗粒示踪分析、western blot法鉴别外泌体形态、粒径大小和特征蛋白表达

2.3 血清外泌体LncRNA NEAT1相对表达量 经qRT-PCR法检测，肝纤维化组、非肝纤维化组、正常对照组人群血清外泌体LncRNA NEAT1相对表达量分别为(1.99±0.78)、(1.23±0.34)、(1.00±0.22)，与正常对照组人群相比，肝纤维化组和非肝纤维化组NASH患者血清外泌体LncRNA NEAT1相对表达量均升高，肝纤维化组患者升高趋势更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 血清外泌体LncRNA NEAT1与NASH患者肝纤维化的关系 根据肝纤维化组患者血清外泌体LncRNA NEAT1相对表达量的中位值和四分位值，划分为4个区间：<1.35，1.35～1.77，1.78～2.58，>2.58。采用多元线性回归模型，校正各种混杂因素后，血清外泌体LncRNA NEAT1>1.77是NASH患者发生肝纤维化的重要独立危险因素之一(P<0.05)(表2)。

表2 血清外泌体LncRNA NEAT1与肝纤维化的多元线性关系

2.5 肝纤维化组患者血清外泌体LncRNA NEAT1与AST/ALT、GGT/PLT、PLR、NLR的关系 经Pearson法分析，肝纤维化组患者血清外泌体LncRNA NEAT1相对表达量与GGT/PLT、NLR呈正相关性，r=0.226,0.320，P<0.05；但是与AST/ALT和PLR未见明显关系，r=0.132,-0.035，P=0.207,0.738(见图2)。

图2 肝纤维化组患者血清外泌体LncRNA NEAT1与AST/ALT、GGT/PLT、PLR、NLR的相关性

2.6 肝纤维化组患者血清外泌体LncRNA NEAT1与肝纤维化病情进展的关系 根据SAF评分，67例患者为F1～F2期轻中度肝纤维化，26例患者为F3～F4进展期肝纤维化，两个亚组患者血清外泌体LncRNA NEAT1相对表达量分别为(1.70±0.55)和(2.76±0.77)，差异有统计学意义(P<0.05)，轻中度肝纤维化患者血清外泌体LncRNA NEAT1相对表达量低于进展期肝纤维化患者。

2.7 血清外泌体LncRNA NEAT1对NASH患者发生肝纤维化以及进展期肝纤维化的诊断价值 经ROC曲线分析，血清外泌体LncRNA NEAT1对于肝纤维化诊断的灵敏度和特异度分别为67.71%和99.96%，曲线下面积为0.889(95%CI：0.884～0.934)(见图3A)。而血清外泌体LncRNA NEAT1对于进展期肝纤维化诊断的灵敏度和特异度分别为76.98%和80.65%，曲线下面积为0.865(95%CI：0.783～0.948)(见图3B)。

图3 血清外泌体LncRNA NEAT1诊断NASH患者出现肝纤维化(A)以及进展期肝硬化(B)的ROC曲线

3 讨论

NAFLD属于常见的慢性进展性肝脏疾病，是引起终末期肝病、肝细胞癌和肝脏移植的主要原因[7]。NAFLD包括多种肝脏病理学变化，例如有些患者表现为脂肪变性而没有其他肝损伤特征，而有些NASH患者会伴或不伴有肝纤维化特征。因此单纯依靠肝脏病理学特征对于晚期纤维化的预测和识别意义不明显。NASH是NAFLD患者发生肝纤维化的必经阶段，而肝纤维化的发生和进展则是NAFLD患者预后的最重要预测因素[8]。因此，早期识别肝纤维化的存在变得越来越重要。Aangulo等[9]学者证实，无论是早期肝纤维化还是进展期肝纤维化都会增加NAFLD患者的死亡风险。

目前，肝组织活检仍然是确认肝纤维化分期的“金标准”。在本研究中，我们纳入的所有肝纤维化患者都完成了肝组织穿刺活检，以确定诊断和进展分期的可靠性。然而，肝组织活检由于具有侵入性、高成本以及主观性较强等不足，而且以现阶段穿刺活检的技术水平，仅有部分患者可实现组织学检查，使其在临床诊断和疾病监测方面的应用受到一定的局限性，并且不适用于高危患者的筛查工作。此外，影像学检查虽然能够发现肝脏脂肪变性的存在，但是若缺少组织学评估，诊断肝纤维化存在一定困难。近年来，一些非侵入性的生物标记物已经被开发出来并被证实可以用于肝纤维化诊断[10]。与肝组织活检不同，这类标志物可在一段时间内可反复检测，且侵犯性小，完成度高。有研究发现，在肝纤维化的转化过程中，细胞外间基质成分(ECM)被释放到外周循环血中，一些ECM相关分子，如PCⅢ、CⅣ、LN、HA等，被用作评估肝纤维化程度的生物标志物[11]。此外，PLT下降、ALT、AST、GGT升高与肝纤维化的进展也密切相关，因此也是判断肝纤维化严重程度的一类间接标志物[12]。而这些血清学标志物都具有一定的滞后性，较影像学变化出现得更晚，且易受其他合并病的干扰，因此，在筛查或诊断早期肝纤维化发生中特异性和灵敏度有限。在本研究中我们也发现肝纤维化组和非肝纤维化组NASH患者BMI、PLT、糖尿病史比例、ALT、AST、GGT、FBG、HOMA-IR、TG、LDL-C、CK-18、PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平升高高于正常对照人群，同时PLT、Alb水平低于正常对照人群；而且与非肝纤维化组患者人群相比，肝纤维化组患者GGT、CK-18、PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平进一步升高，同时PLT水平进一步降低。

在研究中，我们还发现肝纤维化患者血浆外泌体中LncRNA NEAT1相对表达量增加，经多元线性回归分析，校正各项混杂因素后，血清外泌体LncRNA NEAT1>1.77是NASH患者发生肝纤维化的重要独立危险因素之一。Yu等[13]学者证实，在CCl4诱导的小鼠肝组织纤维化模型中，LncRNA NEAT1表达显著增加，而且上调NEAT1表达，通过调节miR-122/KLF6信号轴可以加速原代肝星状细胞活化，包括增加细胞增殖和胶原蛋白表达，说明NEAT1-miR-122-KLF6信号级联反应是肝组织纤维化过程中的重要机制。Jin等[14]学者证实NEAT1可以促进NAFLD患者肝纤维化进程，通过脂肪酸诱导BRL3A细胞建立NAFLD体外细胞模型，在这个过程中，NEAT1表达量逐渐升高，并且可以海绵化吸附miR-506来抑制Gli3的表达，进而调节肝组织纤维化、炎症反应和脂质代谢。上述研究均说明，LncRNA NEAT1在肝组织纤维化早期阶段属于重要的诱导因子。此外，分析血清外泌体与一些现有的肝纤维化诊断标志物的关系时发现，肝纤维化组患者血清外泌体LncRNA NEAT1相对表达量与GGT/PLT、NLR呈正相关性，GGT/PLT、NLR都是用于判断NAFLD患者发生肝纤维化的标志性指标，加上ROC曲线分析结果，说明血清外泌体LncRNA NEAT1对于诊断NASH患者肝纤维化的发生有一定的参考价值，且特异性极高(99.96%)；虽灵敏度不甚理想，但可作为现有的肝纤维化诊断生物学分子系统的补充性指标，包括NFS评分系统(包括年龄、FBG/糖尿病、BMI、PLT、ALB、AST/ALT)、FIB-4评分系统(包括年龄、AST、ALT、PLT)等，以弥补多数指标特异性低的缺点。本研究证实，血清外泌体LncRNA NEAT1相对表达量与肝组织纤维化进展有一定关系，轻中度肝纤维化患者血清外泌体LncRNA NEAT1相对表达量低于进展期肝纤维化患者；经ROC曲线分析，血清外泌体LncRNA NEAT1对于进展期肝纤维化的诊断也有一定的临床价值。Kong等[15]学者利用AdI-GFBPrP1腺病毒处理小鼠或原代肝星状细胞建立体内或体外肝纤维化模型后，发现NEAT1表达量升高，进而诱导细胞自噬，加重肝组织或细胞的进一步纤维化损伤。因此本研究推断LncRAN NEAT1在肝组织纤维化进展阶段也发挥着重要作用。

综上所述，本研究证实LncRNA NEAT1水平升高可能增加了NASH患者发生肝纤维化的风险，因此检测血清外泌体LncRNA NEAT1相对表达量有助于协助临床医师对NASH患者早期肝纤维化的发生作出准确识别，并且对于判断肝纤维化患者疾病进展也有一定的参考价值。