三黄柴术方对急性肝内胆汁淤积性肝损伤大鼠肝脏水通道蛋白8/9表达的影响*

陈 曦 严峻彬 张智慧 姚嘉明 姚侃男 陈芝芸△

1.内江市第一人民医院中医科 (四川 内江， 641100) 2.浙江中医药大学附属第一医院 3.杭州市中医院

急性肝内胆汁淤积性肝病是多种原因引起的胆汁形成、分泌和(或)胆汁排泄异常，胆汁不能正常流入十二指肠而进入血液而引起的肝脏疾病[1]。胆汁的组成中超过95%为水分，水转运功能丧失可能造成胆汁淤积[2-4]。水通道蛋白(AQPs)是一组控制水液进出细胞的特异性通道蛋白，对维持机体正常的水液转运功能起至关重要作用[2,5]。研究发现，水通道蛋白亚型AQP8、AQP9均在肝脏中表达并参与胆汁的转运过程，其表达异常可能参与肝内胆汁淤积的发生发展[6，7]。三黄柴术方是项目组临床上用于治疗肝内胆汁淤积的中药复方，具清热化湿、祛瘀疏肝作用，前期研究发现该方能有效防治急性肝内胆汁淤积大鼠肝组织损伤，降低大鼠血清细胞间黏附分子-1、肿瘤坏死因子-α等炎症因子。本研究通过建立大鼠急性肝内胆汁淤积肝损伤模型，观察三黄柴术方对肝组织AQP8/9表达的影响，为进一步阐明三黄柴术方防治肝内胆汁淤积肝损伤的机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 32只雄性SD大鼠，SPF级，体质量为130～150 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物许可证号[SCXK(沪)2013-0016]，在浙江中医药大学实验动物中心适应性饲养一周后开始实验。

1.2 主要药物及试剂 三黄柴术方由大黄、黄柏、栀子、柴胡、白术按4∶4∶3∶3∶4比例由浙江中医药大学附属第一医院制剂中心制备成水提液。α萘-异硫氰酸酯(ANIT)，由北京百灵威科技有限公司提供，产品编号249447。丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒、总胆红素(TBil)试剂盒、总胆汁酸(TBA)试剂盒均为上海森能-德赛诊断技术有限公司产品；TaKaRa Mini BEST Universal RNA Extraction Kit(产品编号9767)、PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)(产品编号RR036A)、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)(产品编号RR820A)均由宝生物工程(大连)有限公司提供；BCA法蛋白定量试剂盒(产品编号PQ0031)、Potent ECL Kit(产品编号P1425)、β-actin(产品编号ab008-040)、Goat Anti-Mouse IgG(H+L) HRP(产品编号 GAM007)、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) HRP(产品编号GAR0072)均为联科生物技术有限公司产品；全蛋白抽提试剂盒(产品编号KGP2100)为凯基生物技术有限公司产品；AQP8抗体(产品编号sc-81870)、AQP9抗体(产品编号sc-74409)由美国Santa Cruz公司提供。

1.3 主要仪器 日立7020全自动生化分析仪(日本高新技术株会会社)，AB17900PCR荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，多功能酶标仪(美国Thermo公司)，Mini-PROTEAN Tetra(美国Bio Rad公司)，FCE型ProteinSimple化学发光成像系统(美国ProteinSimple公司)。

1.4 实验分组及处理 实验大鼠随机分成正常组、模型组、复方高剂量组及复方低剂量组4组，每组8只。实验第1天开始复方高、低剂量组大鼠分别每天以20 g/(kg·d)、10 g/(kg·d)的三黄柴术方水提液灌胃1次，连续4 d；正常组和模型组每天灌服等容量的生理盐水。实验第3天上午正常组大鼠灌服1 ml/kg麻油1次，其他3组按100 mg/kg剂量灌服1 次4% ANIT麻油溶液。大鼠常规饲养，于实验第5天上午空腹下行3%戊巴比妥钠麻醉后腹腔静脉取血，离心分离血清；取右叶部分肝组织，以10%中性甲醛固定，用于病理观察；其余肝组织投入液氮中，3 h后移入-75℃冰箱中保存。

1.5 观察指标 全自动生化仪检测各组大鼠血清ALT、AST、ALP、TBil、TBA水平。HE染色光镜观察肝组织病理学变化。实时荧光定量 PCR 检测肝组织AQP8、AQP9 mRNA表达，采用相对表达量(2-△△Ct)衡量AQP8、AQP9基因表达水平，引物由生工生物工程(上海)有限公司设计并合成，引物序列见表1。Western blot检测肝组织AQP8、AQP9蛋白表达水平，AlphaView SA软件分析各蛋白的灰度值，以β-actin为内参衡量AQP8、AQP9蛋白的相对表达量。

表1 实时荧光定量 PCR引物序列

2 结果

2.1 各组实验大鼠肝功能的影响情况 见表2。

表2 各组实验大鼠血清肝功能的影响比较

2.2 各组实验大鼠肝组织病理学的影响情况 正常组大鼠肝组织结构完整，无变性坏死、胶原增生等改变；模型组大鼠肝细胞混浊肿胀，可见肝细胞脂肪变，汇管区、小叶周边出现小的胆管增生和少量胶原沉积，有少量炎性细胞浸润；复方高、低剂量组大鼠肝组织病理变化与模型组相似，但程度明显减轻，见图1。

图1 各组实验大鼠肝组织病理学表现 (HE染色，100×)

2.3 各组实验大鼠肝组织AQP8/9蛋白表达的影响 见图2。

图2 各组实验大鼠肝组织AQP8、AQP9蛋白相对表达量比较

2.4 各组实验大鼠肝组织AQP8/9 mRNA的影响 见图3。

图3 各组实验大鼠肝组织AQP8、AQP9 mRNA相对表达量

3 讨论

肝内胆汁淤积是各种原因导致胆汁生成、分泌障碍或胆汁流的停滞或受阻，致使胆汁排出减少，在胆道中蓄积甚至回流入血，血中胆红素和胆汁酸上升，肝细胞内有毒物质(如胆汁酸盐)不断积聚，造成肝脏损伤，血清中的肝脏转氨酶(ALT、AST)含量上升的一类临床综合征[8]。临床治疗上仍无特效药物，主要使用的有熊去氧胆酸、腺苷蛋氨酸等[9]，然而对部分胆汁淤积患者并无效果。肝内胆汁淤积属于中医“黄疸”范畴；三黄柴术方是项目组以《金匮要略》中治疗阳黄的大黄硝石汤基础上加减而得，由大黄、黄柏、栀子、柴胡、白术组成，具有具清热化湿、祛瘀疏肝、利胆退黄作用。本研究发现，三黄柴术方能显著降低ANIT诱导的急性胆汁淤积大鼠血清ALT、AST水平，提示该方可一定程度缓解肝内胆汁淤积时的肝细胞损伤。

水通道蛋白(AQPs)对水具有特殊通透性，在多个组织和器官上表达的完整跨膜蛋白，是存在于细胞膜上的转运水的特异性孔道，在维持机体水代谢平衡过程中起着至关重要的作用[10]，其亚型AQP8、AQP9均在肝脏中表达并参与胆汁的转运过程[11,12]。研究发现，胆小管胆汁分泌与AQPs的选择性表达和协同调控有关[13]。AQP8 在围绕中央静脉的肝细胞毛细胆管膜和胆囊上皮细胞上表达[14]，是肝细胞中最丰富的水通道蛋白，其主要通透水分子[15]。AQP8基因敲除小鼠胆汁分泌量明显减少，且使用胆盐刺激，加快胆汁分泌速度后其胆汁分泌量仍少于正常组小鼠[16]。脂多糖诱导的胆汁淤积症模型中，AQP8的表达显著下降[17]。AQP9则统一分布于肝小叶内，集中于肝细胞的窦基底膜中，可以渗透水和除水以外的多种小分子中性物质，也称作“广泛选择性通道”[11,18]。研究表明，AQP9与胆汁形成过程中水的跨细胞转运有关[13,19]。通过对大鼠行胆道结扎术的研究发现[20]，术后1～7 d中AQP9蛋白在肝细胞基底外侧膜表达明显减少，而在细胞内膜表达显著增加，7 d以后结扎大鼠肝细胞膜上表达的AQP9总量下降，导致基底膜渗透水的功能下降，大量胆汁堆积在肝细胞内。本研究发现，ANIT诱导的急性胆汁淤积性肝损伤大鼠肝脏AQP8/9表达水平下降，同时，ALT、AST、ALP、TBil、TBA水平明显增高，提示性胆汁淤积时肝组织AQP8/9下调导致其介导水转运的能力降低，肝细胞膜对水的通透性减低，致使胆汁分泌失常，出现肝损伤；三黄柴术方能在一定程度上拮抗AQP8/9的低表达，降低胆汁酸分泌和保护肝细胞，提示三黄柴术方可能通过调节AQP/9的表达而改善ANIT诱导的急性肝内胆汁淤积性肝损伤。