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隔日禁食结合济饥辟谷方对NAFLD大鼠肝脏氧化应激及IRS 2的影响*

2021-11-02骆建兴扈晓宇

中西医结合肝病杂志 2021年10期
关键词:辟谷禁食肝细胞

张 扬 骆建兴 杨 芳 扈晓宇

成都中医药大学附属医院感染科 (四川 成都, 610072)

间歇性禁食也称轻断食,是一种正常饮食和禁食交替进行的饮食疗法,包括时间限制禁食、隔日禁食和周期性禁食等。由于患者较易坚持,间歇性禁食在人群中流行较广。作为全球性公共卫生问题,非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发生发展的病理机制复杂,其中氧化应激及胰岛素抵抗(IR)发挥着关键作用。动物实验和临床研究已证实,隔日禁食可在短期内改善NAFLD及肝脏氧化应激[1-3]。先前研究表明,隔日禁食结合济饥辟谷方能控制小鼠体质量增加和良性调节血糖、血脂[4],但两者结合对NAFLD的影响尚未见报道。故本文研究隔日禁食结合济饥辟谷方对NAFLD大鼠肝脏氧化应激及胰岛素受体底物(IRS)2 mRNA的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料与仪器 清洁级雄性SD大鼠,5~6周龄,体质量(160±10)g,共44只,购自成都达硕实验动物有限公司[生产许可证为SCXK(川)2015-030]。高脂饲料(含41.6 kcal%脂肪,TP26300)和低脂对照饲料(含12.5 kcal%脂肪,TP26312)由南通特洛菲饲料科技有限公司生产[生产许可证号:苏饲证(2014)06092]。结合文献[4],利用现代加工技术将济饥辟谷方(黑豆、火麻仁、糯米等)制成干脆块状。BCD-236H型-70℃电冰箱(中国海尔集团有限公司),KDC-2046型低速冷冻离心机(科大创新股份有限公司),721型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),7170A型全自动生化分析仪(日本日立公司),转轮式切片机(德国徕卡公司),TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机和PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司),BMJ-Ⅲ型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂),BA400Digital型数码三目摄像显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司),图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics公司)。超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所),4%多聚甲醛固定液(国药集团化学试剂有限公司),PBS磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司),无水乙醇AR级(江苏海兴化工有限公司),二甲苯AR级(天津致远化学试剂有限公司),中性树胶(国药集团化学试剂有限公司)等。

1.2 动物分组、干预及标本采集 44只健康雄性SD大鼠,经适应性饲养后,随机分为两组,正常对照组(n=12)采用低脂饲料喂养12周;高脂饲料组(n=32) 参照文献[5]方法,采用高脂饲料喂养12周,构建NAFLD大鼠模型。12周后,每组各取2只处死,行病理检测确定模型成功后,高脂饲料组随机分为模型组、隔日禁食组、结合济饥辟谷方组,每组10只,干预4周。隔日禁食采取第1天早9∶00投饲,第2天早9∶00撤回,如此往复。各组大鼠分笼饲养于(25±2)℃、明暗各12 h的动物实验室内,自由饮水。于实验第16周末,大鼠禁食12 h后,4%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉,股动脉取血,取肝右叶相同部位(距离肝边缘0.5cm处)组织若干,用于相关检测。

1.3 观察项目 ①血脂及肝功能测定:采集的血液在4℃下3 000 r/min离心10 min,取上层血清,用全自动生化分析法检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等。②肝脏病理检查:取肝组织置于4%多聚甲醛中固定,制备冰冻切片及石蜡切片,油红O和TUNEL染色观察肝细胞脂质沉积和凋亡情况,HE染色观察肝组织形态学改变。③肝脏氧化应激指标测定:取肝组织加冷生理盐水制成10%肝匀浆,离心,取上清液,采用试剂盒检测SOD、GSH和MDA。④肝脏IRS2 mRNA表达:用TRIzol试剂提取肝组织总RNA,利用随机六聚体引物反转录合成cDNA,使用LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green 1试剂盒进行实时RT-PCR。IRS-2引物序列(GenBankTMNM-003749):上游:5′-ACAACAACCACAGCGTGCGC-3′,下游:5′-GTAGAGGGCGATCAGGTACTTG-3′。β-actin引物序列(GenBankTMNM-001101):上游:5′-GCAAGAGAGGCATCCTCACC-3′,下游:5′-CGTAGATGGGCACAGTGTGG-3′。反应体积为20 μl,含有LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green 1,4 mmol/L MgCl2,0.5 μmol/L上游和下游PCR引物及2 μl cDNA。扩增反应如下进行:50℃ 2 min,95℃ 10 min,95℃ 15 s,60℃ 1 min,循环40次。仪器自动计算CT值。

2 结果

2.1 各组大鼠血脂及肝功能的比较 与正常对照组比较,模型组血清TC、TG、ALT、AST水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,隔日禁食组及结合济饥辟谷方组均能显著降低血清TC、TG、ALT、AST水平(P<0.05),并且结合疗法的效果优于隔日禁食组。见表1。

表1 各组大鼠血脂及肝功能情况比较

2.2 各组大鼠肝脏氧化应激及胰岛素抵抗指标的比较 与正常对照组比较,模型组肝脏MDA含量升高、SOD和GSH活性降低、IRS 2 mRNA表达下降(P<0.05);与模型组比较,单纯隔日禁食及结合济饥辟谷方治疗均能促进肝脏MDA含量、SOD和GSH活性、IRS 2 mRNA表达的恢复(P<0.05),并且二者结合的效果优于隔日禁食组。见表2。

表2 各组大鼠肝组织氧化应激指标情况

2.3 各组大鼠肝脏油红O染色的变化 正常对照组肝细胞排列整齐,间隙清晰,未见红染脂滴。与正常对照组比较,模型组肝细胞明显肿胀,脂质沉积,可见弥漫性的红染脂滴及脂滴融合。与模型组比较,隔日禁食组及结合济饥辟谷方组均能减少脂质沉积,其中二者结合的效果更佳。见图1。

图1 各组大鼠肝组织油红O染色(400倍)

2.4 各组大鼠肝脏TUNEL染色的变化 正常对照组肝组织未见核呈棕褐色的凋亡细胞。与正常对照组比较,模型组肝组织内出现大量棕褐色凋亡细胞。与模型组比较,隔日禁食组及结合济饥辟谷方组均能减少凋亡细胞,其中二者结合的效果更佳。见图2。

图2 各组大鼠肝组织TUNEL染色(400倍)

2.5 各组大鼠肝脏HE染色的变化 正常对照组肝细胞形态正常,结构完整,未见明显脂肪变性及炎性细胞浸润。与正常对照组比较,模型组肝细胞内出现大量大小不等的脂滴空泡,小叶中可见点状坏死及炎性细胞浸润,部分肝细胞肿胀,胞质疏松,甚至气球样变。与模型组比较,隔日禁食组及结合济饥辟谷方组均能缓解肝脏脂质沉积、炎性细胞浸润及肝细胞损伤(气球样变和点状坏死),其中二者结合的效果更佳。见图3。

图3 各组大鼠肝组织HE染色(400倍)

3 讨论

本研究发现,单纯隔日禁食或隔日禁食结合济饥辟谷方均可显著提高NAFLD大鼠肝脏抗氧化物酶活性,减轻氧化应激,而改善肝脏脂质沉积及肝细胞损伤,且两者结合组的效果更优。

NAFLD的发病机制尚未完全阐明,目前广为接受的是“二次打击”学说。第一次打击是IR导致肝脏脂质沉积,第二次打击主要是氧化应激致使肝脏的进一步损害[6]。线粒体是脂肪酸进行β-氧化和三羧酸循环、ATP合成及氧自由基(ROS)形成的主要场所。肝细胞内脂质超载促使过多的脂肪酸进入β-氧化途径,进而增加ROS的产生,大量生成的ROS超过抗氧化系统清除能力时便发生氧化应激。蓄积的ROS与膜磷脂的不饱和脂肪酸反应形成脂质过氧化产物(LPO),后者又可加重线粒体损伤,增加肝细胞脂质沉积和ROS产生,如此恶性循环,最终导致肝细胞凋亡、肝脏炎性及纤维化[7,8]。本研究结果显示,模型组肝脏脂质过氧化反应产物MDA含量升高,而抗氧化酶SOD、GSH活性降低。提示NAFLD大鼠脂质过氧化增加,抗氧化酶大量消耗,继而引发肝细胞氧化应激损伤。因而提高肝细胞抗氧化能力使之适应脂质超负荷,对于缓解病情具有重要意义。

隔日禁食是间歇性禁食的主要形式之一。有研究认为,隔日禁食可以在不减少热量摄入的情况下降低多种疾病的风险[9]。据报道,隔日禁食可提高年龄相关性淋巴瘤小鼠脾脏SOD、GSH活性,降低MDA含量,减少ROS产生而延长寿命[10]。它也能增加糖尿病大鼠肾脏SOD 活性,减少MDA 含量,而延缓糖尿病肾病的进展[11]。本研究结果表明,隔日禁食结合济饥辟谷方可提高NAFLD大鼠肝组织抗氧化酶活性,减轻氧化应激损伤,并对胰岛素信号通路中关键信号分子IRS 2 mRNA表达有调节作用。

既往证实,NAFLD常存在IR,伴有高血糖、高胰岛素血症及胰岛素敏感性下降。肝脏是胰岛素作用的靶器官,当存在高胰岛素血症时,肝糖输出持续增加,加重高血糖、高胰岛素血症及IR[12]。有研究认为,肝脏IR是NAFLD进展的启动环节,而肝脏局部氧化应激的产生可能是诱发肝脏IR的关键环节[13]。可以推测,隔日禁食结合济饥辟谷方对NAFLD大鼠肝脏IR的改善作用可能与减轻氧化应激有关。

《服气精义论·服药论》言:“夫五脏通荣卫之气,六腑资水谷之味。……又既绝谷,则腑味之不足。”又言:“谷不入半日,则气衰;一日,则气少。故须诸药以代于谷,使气味兼致脏腑而全也。”认为辟谷必须服饵。有研究对古代中医文献中服饵辟谷方剂的用药规律进行分析,发现服饵辟谷组方选药首重安全,尽量选择无毒无害服用安全性高的药物;总体上用药平和,以甘味药与平性药为主,遵循甘缓平补之法;用药多归脾肺二经,着重调节辟谷期间体内气的生化与运行[14]。济饥辟谷方是一个代表性的服饵辟谷组方,由黑豆、火麻仁、糯米等高蛋白食物组成,可使患者“气足不思食”。

综上,隔日禁食结合济饥辟谷方能减少NAFLD大鼠肝脏脂质沉积及肝细胞损伤,其发挥作用的机制与改善肝脏氧化应激和IR有关。二者结合既能提高个体对饥饿的耐受性,亦可提高治疗效果,对NAFLD的治疗提供新思路、新方法,值得深入探讨。

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