不同程度非酒精性脂肪性肝病患者血清炎症因子及免疫因子表达的研究*

罗 娟 闫再宏 梁慧霞

河北中石油中心医院消化内科 (河北 廊坊， 065000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是临床常见的肝病，包括非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)、脂肪性肝炎(NASH)及NAFLD相关的肝纤维化及肝硬化，NASH是引起肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌的独立危险因素，早期确诊、早期治疗可延缓肝纤维化、肝硬化及恶变进程[1]。因此在临床工作中对NAFL与NASH的鉴别诊断非常重要，肝活检是目前鉴别诊断NAFL和NASH的金标准，但其属于有创操作，技术要求高，且存在致命性并发症风险，因此具有一定的局限性，未能在基层医院普及开展[2]。

临床上需要寻找其他更安全、简便的方法来诊断、区分NAFL和NASH。NAFLD的发病机制比较复杂，已有的研究认为遗传易感性、免疫功能紊乱、脂质代谢异常、氧化应激、内质网应激、细胞因子、内毒素等均参与病情进展[3]。故本研究旨在通过观察不同程度NAFLD患者血清中炎症因子及免疫因子的表达，探讨血清炎症因子及免疫因子在NAFLD病情诊断中的意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月至2020年1月在我院治疗的NAFLD患者80例(NAFLD组)，根据脂肪肝程度分为：轻度患者25例，中度患者31例，重度24例。纳入标准：①诊断符合《非酒精性脂肪肝病防治指南(2018年更新版)》中的标准[4]；②无病毒性肝炎、药物性肝炎等其他肝脏疾病者；③患者签署知情同意。排除标准：①有精神疾病史者；②患者合并有恶性肿瘤、糖尿病、内分泌疾病等其他疾病。同时选取健康体检者80例作为对照组，两组人群一般资料比较见表1。

表1 两组人群一般资料比较

1.2 检查方法 所有研究对象均于清晨抽取空腹静脉血，分为两份，一份在4℃条件下以转速3 500 r/min离心10 min，取血清采用流式细胞学检测IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平。经包被、加酶标抗体、加底物显色、终止后在相应波长处检测吸光度，代入标准曲线计算含量。检测仪器：美国伯腾公司ELX800多功能酶标仪，试剂盒生产厂家：上海酶联生物科技有限公司。一份采用流式细胞术检测CD4+、CD8+和CD4+CD25+，静脉血以EDTA抗凝，加入红细胞裂解液室温孵育15 min，PBS洗涤2次。加入抗人抗体TITC-CD4、PE-CD8、APC-CD25，于4℃反应40 min。加入固定剂室温孵育15 min，PBS洗涤1次。加入穿透剂、抗人抗体PE-Foxp3，于4 ℃反应40 min。检测前用校准荧光微球校正仪器，采用CellQuest软件分析结果。检测仪器：美国贝克曼库尔特AQUIOS CL流式细胞仪。

2 结果

2.1 两组人群血清炎症因子、免疫功能比较 NAFLD组患者血清IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α和CD4+明显高于对照组(P<0.05)，而CD8+和CD4+CD25+明显低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组人群血清炎症因子、免疫功能表达水平比较

2.2 不同程度NAFLD患者血清炎症因子、免疫功能比较 不同程度NAFLD患者性别、年龄及吸烟比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。重度NAFLD患者血清IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α和CD4+表达水平明显高于轻度和中度患者(P<0.05)，而CD8+和CD4+CD25+表达水平明显低于轻度和中度患者(P<0.05)；中度患者IL-17和IL-18表达水平明显高于轻度患者(P<0.05)，而CD8+和CD4+CD25+表达水平明显低于轻度和中度患者(P<0.05)。见表3。

表3 不同程度NAFLD患者血清炎症因子、免疫功能比较

2.4 NAFLD组患者血清炎症因子、免疫指标与疾病严重程度相关性分析 将NAFLD组患者血清炎症因子、免疫指标与疾病严重程度进行Spearman相关分析，结果显示：IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α、CD4+表达水平与疾病严重程度呈正相关(rs=0.565、0.532、0.311、0.304和0.321，P<0.05)，CD8+和CD4+CD25+与严重程度呈负相关(rs=-0.511和-0.503，P<0.05)。

3 讨论

NAFLD以弥漫性肝实质细胞脂肪变性、脂肪蓄积为病理特征，多数患者早期无明显症状，偶见消化不良、肝区隐痛、肝脾肿大等非特异性症状或体征[5]。NAFLD的发生与不合理的饮食结构密切相关，近年来其发病率呈现逐渐升高的趋势，已逐渐发展为常见的慢性肝脏疾病，如不及时给予干预，可逐步进展至肝纤维化、肝硬化及肝细胞癌等严重病变阶段[6]。在临床工作中，应注意区分NAFL和NASH患者，但目前尚缺乏安全、操作简便、价格低廉的诊断方法[7]。

NAFLD的发病机制复杂，目前公认的学说是“二次打击”， 第一次打击是由于高甘油三酯血症导致的肝细胞脂肪浸润，导致胰岛素抵抗。第二次打击是多余的脂肪导致炎症、纤维化、细胞坏死，氧化应激、内质网应激、炎症细胞因子、内毒素参与这一过程[8，9]。因此炎症因子、免疫指标可能对NAFLD病情具有一定的提示作用[10]。TNF-α是由脂肪组织中巨噬细胞分泌的炎症因子，可引起外周胰岛素抵抗，并能刺激激素敏感性脂肪酶，导致游离脂肪酸水平升高[11]。在肝脏中TNF-α由Kupffer细胞产生，通过toll样受体介导脂肪肝的发生。IL-17是由CD4+和 CD8+T淋巴细胞产生，启动炎症级联反应[12]。动物实验已经证实，IL-17与肝脏脂肪变性、NAFLD的发生相关，促进NAFLD从单纯性脂肪变性向NASH的转变[13]。IL-18是由巨噬细胞、Kupffer细胞、内皮细胞合成的炎症因子，可诱导趋化因子、粘附分子和其他促炎细胞因子的产生，可与内毒素协同诱导肝脏损伤，导致肝脏炎症、纤维化和坏死[14]。IL-22 的靶器官是肝脏，与急性期蛋白、组织修复相关蛋白质表达的诱导有关[15]。

本研究发现，NAFLD患者血清IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平明显高于健康体检者，NAFLD重度患者血清IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平明显高于轻度和中度患者；IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平与NAFLD严重程度呈正相关。这一结果提示，可将IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α等指标作为NAFLD诊断和病情评估的潜在辅助指标。这是由于NAFLD病变可导致脂肪组织中的炎症细胞分泌大量的炎症因子，可引起胰岛素抵抗、肝细胞炎性损伤。在这一病变过程中启动一系列炎症级联反应，引起IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α水平升高，其肝脏炎性损伤越严重，上述炎症指标水平越高。

NAFLD的发生、发展过程伴随着免疫微环境的变化，CD4+、CD8+T淋巴细胞、调节性T细胞CD4+CD25+表达异常可能是其病理机制之一[16]。本研究发现，NAFLD患者CD4+水平明显高于健康体检者，而CD8+和CD4+CD25+水平明显低于健康体检者。NAFLD重度患者CD4+水平明显高于轻度和中度患者，而CD8+和CD4+CD25+水平明显低于轻度和中度患者。CD4+水平与NAFLD严重程度呈正相关，CD8+和CD4+CD25+水平与NAFLD严重程度呈负相关。这一结果提示，可将CD4+、CD8+和CD4+CD25+等指标作为NAFLD诊断和病情评估的辅助指标。这是由于CD4+T淋巴细胞是机体免疫应答的 主要反应细胞，可增强其他免疫细胞功能。CD8+T淋巴细胞对靶细胞产生细胞介导的细胞毒作用，并调节性抑制CD4+T淋巴细胞，两者的稳定比例维持细胞免疫平衡。NAFLD患者CD4+T淋巴细胞比例升高、CD8+T淋巴细胞比例下降而引起机体免疫紊乱状态。CD4+CD25+可通过分泌抑制性细胞因子、抗氧化应激、调控Th1/Th2平衡等途径维持机体免疫稳态，延缓NAFLD病程进展，其水平的下降可加重免疫紊乱状态。

基于炎症反应和免疫反应在NAFLD病变过程中的重要作用，本研究选择血清炎症因子IL-17、IL-18、IL-22、TNF-α和免疫指标CD4+、CD8+和CD4+CD25+为指标，发现NAFLD患者血清炎症因子及免疫指标异常，与患者严重程度存在一定相关性。今后可将其作为诊断和评估NAFLD病情的辅助指标。但本研究并未能筛选上述指标联合检测的特异性和敏感性，尚存在一定的不足，在今后的工作中可进一步探讨指标联合检测的意义。