七氟醚调控miR-34a/HMGB1表达抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和侵袭

李修志 李加鹏

目前，外科手术仍是肿瘤治疗的重要手段，但术后出现的复发和转移是影响治疗的重要因素。因此，如何在围术期抑制肿瘤细胞的恶性增殖和转移一直是学者们研究的重要课题。麻醉药是手术过程中不可或缺的存在，其对肿瘤细胞的影响逐渐引起人们的关注。七氟醚是一种广泛应用于实体瘤切除手术麻醉诱导和维持的吸入麻醉剂，在肿瘤围手术期发挥着重要作用。大量研究显示，七氟醚对乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌和肺癌等恶性肿瘤细胞增殖和侵袭等具有一定的抑制作用[1-4]。微小RNAs(miRNAs)是一类与肿瘤发生发展关系密切的小分子RNA，在肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等生物学过程中发挥着重要作用。已有研究证实，七氟醚可通过调控miRNAs的表达影响结直肠癌和胶质瘤等肿瘤细胞的生物学过程[5,6]。miR-34a在乳腺癌组织和细胞中异常低表达，其过表达可抑制癌细胞增殖和侵袭[7]；七氟醚被证实可通过上调miR-34a的表达抑制胃癌和结肠癌的发生发展[8,9]，但其是否通过调控miR-34a表达影响乳腺癌细胞的恶性进展尚不清楚。本研究以乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象，通过观察七氟醚对MDA-MB-231细胞中miR-34a表达的影响，探讨miR-34a是否以及如何参与七氟醚抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人乳腺癌MDA-MB-231细胞株(中国科学院上海细胞所细胞库)，miR-34a模拟物、miR-34a抑制剂及其相应的阴性对照miR-NC和anti-miR-NC(广州瑞博生物)，青链霉素、胰酶消化液、胎牛血清、DMEM培养基(美国GIBCO公司)，二甲基亚枫和MTT试剂(美国Sigma公司)，HMGB1单克隆抗体和β-actin 单克隆抗体(美国Santa Cruz 公司)，Matrigel (美国BD公司)，PVDF 膜(美国Millipore公司)，引物(上海英骏生物)，发光底物 ECL、BCA蛋白检测试剂盒、逆转录试剂盒和双荧光素酶报告基因检测试剂盒(碧云天生物公司)，Transwell 小室(美国Corning公司)，七氟醚挥发罐(美国Abott公司)。

1.2 细胞培养及七氟醚处理 采用含有10%胎牛血清、100 U/ml青链霉素的DMEM培养基于37℃、5%CO2的细胞培养箱中常规培养MDA-MB-231细胞。将对数生长期的MDA-MB-231细胞以适当密度种植于96孔细胞板上，培养箱内常规培养过夜。将其分为对照组、1.7%七氟醚组、3.4%七氟醚组和5.1%七氟醚组，并置于两侧壁分别装有进气口和出气口的无菌密闭的玻璃箱中，并采用麻醉机和麻醉气体监测仪连接进气口和出气口。其中对照组按照6 L/min通入5%CO2和95%O2的混合气体处理4 h，而其余3组分别以1.7%、3.4%和5.1%七氟醚6 L/min处理4 h。各组细胞处理结束后，放入细胞培养箱内常规培养48 h。分别采用MTT法检测细胞的增殖率，克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力，Transwell小室检测细胞的侵袭能力，RT-PCR检测细胞中miR-34a和HMGB1 mRNA的表达，Western blot检测HMGB1蛋白的表达。

1.3 细胞增殖实验 将长势良好的对数生长期MDA-MB-231细胞以每孔1×104个密度种植于96孔细胞板上，培养箱中常规培养24 h。将其按照1.2中的分组和七氟醚处理结束后，于培养箱内继续培养48 h。加入5 g/L的MTT溶液反应4 h，再加入150 μl二甲基亚枫溶解蓝紫色结晶。使用酶标仪在570 nm波长处检测各组细胞的吸光度值。按照公式：细胞增殖率(%)=(实验孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)×100%计算各组细胞的增殖率。实验重复3次。

1.4 细胞克隆形成实验 将对数生长期的MDA-MB-231细胞按照每孔300个细胞接种于6孔细胞板上，使细胞分布均匀后，置于培养箱内培养6 h。再按照1.2中的分组与处理进行七氟醚刺激。待七氟醚刺激结束后，移入培养箱内常规培养14 d。取出培养板，吸取培养液后，采用磷酸缓冲液洗涤细胞后，分别加入1 ml 的甲醇固定和200 μl的姬姆萨染色20 min后，以自来水洗去染液后，晾干。置于显微镜下观察克隆数(>50个细胞)，并以克隆数与接种细胞数的百分比表示各组细胞的克隆形成率。

1.5 细胞侵袭实验 将对数生长期的MDA-MB-231细胞以每孔1×104个密度接种至24孔细胞板上，于细胞培养箱内常规培养过夜。根据1.2中的分组及处理给予不同浓度的七氟醚处理后，转入细胞培养箱中常规培养24 h。胰蛋白酶消化收集各组细胞后，取细胞悬液(浓度为1×104个/ml)200 μl加入到 Matrigel基质胶包被的Transwell小室上室中，而下室内加入含10%胎牛血清的培养基500 μl。常规培养24 h后，分别以甲醛固定和结晶紫染色15 min。使用棉签小心除去上室内残留的细胞后，显微镜下随机选取6个视野观察穿过微孔滤膜的细胞数。实验重复3次。

1.6 miR-34a和HMGB1mRNA表达的检测 收集对照组、1.7%七氟醚组、3.4%七氟醚组和5.1%七氟醚组细胞，以Trizol法提取细胞总RNA后，根据逆转录试剂盒说明书步骤将RNA逆转录为cDNA。再以1.5 μl cDNA为模板，加入12.5 μl Master Mix、各2 μl的上下游引物和7 μl的ddH2O配成25 μl的PCR反应体系。按照95℃ 7 min，1个循环；95℃ 30 s，58℃ 30 s ，72℃ 4 min，共40个循环的反应条件上PCR仪进行扩增，以U6和β-actin为内参，2-ΔΔCt法计算各组细胞中miR-34a和HMGB1mRNA的表达水平。

1.7 HMGB1蛋白表达的检测 向收集到的5.1%七氟醚组、3.4%七氟醚组、1.7%七氟醚组和对照组细胞中加入细胞裂解液于冰上裂解提取总蛋白后，参照BCA蛋白检测试剂盒步骤流程检测总蛋白的浓度。按照1∶4比例加入5×上样缓冲液，放入沸水中变性5 min。使用微量加样器向SDS-PAGE凝胶中加入蛋白样品10 μl进行电泳分离。以转膜仪转膜后，置于含5%脱脂奶粉的TBST工作液中封闭1.5 h。封闭结束后，将膜转入一抗工作液中4℃下孵育过夜。以TBST工作液漂洗3次后，将膜放入二抗工作液中常温孵育1 h。以ECL暗室内显影后，Image J图象分析软件分析HMGB1蛋白条带的灰度值，并以内参β-actin进行校正。

1.8 实验分组与细胞转染 实验分为对照组(未处理)、七氟醚组(给予5.1%七氟醚刺激)、七氟醚+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC后给予5.1%七氟醚刺激)和七氟醚+anti-miR-34a组(转染miR-34a抑制剂后给予5.1%七氟醚刺激)。将对数生长期的MDA-MB-231细胞以每孔1×105个密度接种至6孔细胞板上，置于培养箱中常规培养。待细胞融合度达70%时，按照脂质体2000说明书步骤将miR-34a抑制剂及其相应对照anti-miR-NC转染至七氟醚+anti-miR-34a组和七氟醚+anti-miR-NC组细胞中。转染24 h后，给予5.1%七氟醚刺激4 h。按照实验分组处理结束后，分别进行增殖实验、克隆形成实验、侵袭实验以评价miR-34a对七氟醚刺激下MDA-MB-231细胞增殖和侵袭的影响。

1.9 荧光素酶实验 TargetScanHuman软件预测发现HMGB1 3’-UTR区域有能够与miR-34a互补的核苷酸序列，猜测HMGB1可能是miR-34a的靶基因。为了验证两者的靶向关系，通过构建含HMGB1 3’-UTR序列的野生型(HMGB1-WT)和突变型(HMGB1-MUT)的荧光素酶报告载体质粒，并参照脂质体2000说明书步骤行miR-NC(miR-34a模拟物阴性对照)+HMGB1-WT、miR-34a(miR-34a模拟物)+HMGB1-WT、miR-NC+HMGB1-MUT、miR-34a+HMGB1-MUT 4组共转染。转染48 h后，检测各组细胞的荧光素酶活性，具体的检测流程参照荧光素酶活性检测试剂盒说明书。实验检测3次。

1.10 统计学分析 应用SPSS 22.0统计软件，多组间比较使用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，2组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 七氟醚抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和侵袭 1.7%、3.4%和5.1%浓度的七氟醚作用后MDA-MB-231细胞增殖率和克隆形成率以及侵袭细胞数均呈浓度依赖性降低，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 4组细胞增殖率、克隆形成率和侵袭细胞数比较

2.2 HMGB1是miR-34a的靶基因 HMGB1 3’ UTR存在能够与miR-34a互补结合的核苷酸序列。与HMGB1-WT共转染的miR-34a组细胞的荧光素酶活性较miR-NC组显著降低(P<0.05)，而与HMGB1-MUT共转染的miR-34a组和miR-NC组细胞的荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、3。

表2 HMGB1 3’ UTR与miR-34a的结合位点

表3 4组细胞荧光素酶活性的比较

2.3 七氟醚促进乳腺癌MDA-MB-231细胞中miR-34a表达而抑制HMGB1表达 与对照组比较，不同浓度的七氟醚刺激后MDA-MB-231细胞中miR-34a表达水平显著升高，而HMGB1 mRNA和蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)，且具有浓度依赖性。见图1，表4。

2.4 miR-34a低表达逆转七氟醚对乳腺癌MDA-MB-231细胞中HMGB1表达的抑制作用 与对照组比较，七氟醚刺激后MDA-MB-231细胞中miR-34a表达水平显著升高，而HMGB1mRNA和蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)；与七氟醚组比较，七氟醚+anti-miR-34a组细胞中miR-34a表达水平显著降低，而HMGB1mRNA和蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)；然而，miR-34a和HMGB1在七氟醚+anti-miR-NC组和七氟醚组细胞中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2，表5。

图1 Western blot检测HMGB1蛋白的表达

表4 4组细胞中miR-34a、HMGB1 mRNA和HMGB1蛋白表达比较

图2 Western blot检测HMGB1蛋白表达

2.5 miR-34a低表达逆转七氟醚对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和侵袭的抑制作用 与对照组比较，七

表5 4组细胞中miR-34a、HMGB1 mRNA和HMGB1蛋白表达比较

氟醚刺激后MDA-MB-231细胞的增殖率、克隆形成率和侵袭细胞数均显著降低(P<0.05)；与七氟醚组比较，细胞增殖率、克隆形成率和侵袭细胞数在七氟醚+anti-miR-NC组中无显著改变(P>0.05)，但在七氟醚+anti-miR-34a组中均显著升高(P<0.05)。见表6。

表6 4组细胞增殖率、克隆形成率和侵袭细胞数比较

3 讨论

乳腺癌是女性中发病率很高的恶性肿瘤，严重威胁女性的身体健康和生命安全。随着科学界对麻醉药研究的深入，临床常用的麻醉药——七氟醚对乳腺癌的影响逐渐受到关注。Xu等[10]研究指出，七氟醚可通过下调MMP-9抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭和迁移。Yao等[11]研究发现，七氟醚可通过抑制NF-κB活性下调转移相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达抑制乳腺癌AU565细胞的增殖和转移。另外，Liu等[12]研究指出，七氟醚可通过上调miR-203表达抑制乳腺癌细胞增殖。可见，七氟醚对乳腺癌细胞的恶性增殖和侵袭具有一定的抑制作用，但其具有的影响机制尚不完全明确。

Li等[8]在胃癌的研究中发现，七氟醚减弱胃癌MGC-803细胞的黏附能力与上调miR-34a的表达有关。Shan等[9]在结直肠癌的研究中指出，miR-34a表达上调是七氟醚抑制HCT116细胞增殖、侵袭和迁移的重要机制。众所周知，miRNAs在乳腺癌细胞的增殖和转移过程中扮演着重要角色，其成员miR-34a被证实在乳腺癌细胞中低表达，而上调其表达可抑制乳腺癌胞MCF-7、MDA-MB-231细胞的增殖和侵袭[13]。因此，猜测七氟醚是否是通过上调miR-34a表达影响乳腺癌细胞的恶性进展。为了验证是猜想，本研究以1.7%、3.4%和5.1%七氟醚处理乳腺癌MDA-MB-231细胞4 h后发现，七氟醚除了可呈浓度依赖性抑制MDA-MB-231细胞增殖和侵袭外，还可引起miR-34a表达的升高。同时，通过转染miR-34a抑制剂成功下调miR-34a表达后发现，七氟醚对MDA-MB-231细胞增殖和侵袭的抑制作用得到部分逆转。这提示miR-34a在七氟醚抑制MDA-MB-231细胞增殖和侵袭过程中发挥积极作用。

HMGB1是一种高度保守的核内非组蛋白染色体结合蛋白，在宫颈癌、胃癌和肺癌等多种肿瘤组织和细胞中异常高表达，与肿瘤浸润和转移关系密切，可通过促进细胞的增殖和侵袭等在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要促进作用[14-16]。HMGB1在乳腺癌组织中异常高表达，与肿瘤细胞分化、肿瘤TNM分期和淋巴结转移等有关；上调其表达可增强肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，而下调其表达可降低细胞的增殖与侵袭[17,18]。Chandrasekaran等[19]证实，miR-34a可通过靶向下调HMGB1抑制宫颈癌和结直肠癌细胞细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究进一步采用生物信息学软件预测miR-34a的靶基因，最终将HMGB1作为研究对象。HMGB1 3’ UTR区域存在与miR-34a结合的核苷酸序列，并且荧光素酶实验证实，miR-34a可与HMGB1 3’ UTR位点结合降低转染含HMGB1 3’-UTR序列的野生型(HMGB1-WT)质粒的荧光素酶活性；同时下调miR-34a表达可引起HMGB1表达升高。这表明HMGB1是miR-34a的靶基因。Wang等[20,21]分别在肺癌和肝癌的研究中证实七氟醚可抑制HMGB1的表达。本研究以1.7%、3.4%和5.1%七氟醚处理后发现，乳腺癌MDA-MB-231细胞中HMGB1表达水平逐渐降低。结合前面研究表明，下调miR-34a可通过靶向上调HMGB1表达促进MDA-MB-231细胞增殖和侵袭，进而逆转七氟醚对MDA-MB-231细胞增殖和侵袭的抑制作用。结果提示，七氟醚可通过上调miR-34a表达引起HMGB1表达下降进而减弱MDA-MB-231细胞增殖和侵袭。

综上所述，七氟醚可通过调控miR-34a/HMGB1表达抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和侵袭。该结果进一步丰富了七氟醚抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭的分子机制，也为临床围术期使用七氟醚防治乳腺癌的恶性进展提供了新线索。