过表达miRNA-217由P13/AKT信号通路促进膀胱癌T24细胞增殖作用

陈先平 窦红珍 刘庆丰 宋志东 陈康

膀胱癌是泌尿系统中最为常见的恶性肿瘤，男性发病率显著高于女性。膀胱癌具有时间上反复发作和空间上多中心性的特点，并且具有局部浸润转移、术后复发率高的生物学特点[1]。微小RNA(miRNA)是真核生物以及某些大型病毒中存在的，长度为20～24个核苷酸的一类内源性非编码单链小分子RNA。miRNA具有调节性，可与mRNA的3’UTR互补结合，使mRNA的翻译被抑制或导致mRNA的稳定性降低，从而负调节mRNA的表达[2]，进而调控细胞发育、分化以及凋亡等多种生物学功能[3]。miRNA表达的异常以及生物合成的紊乱是许多癌细胞的重要特征，研究表明，不同的miRNA在肿瘤发生过程中发挥抑癌或致癌的不同功能[4]。例如miRNA-143可以抑制结直肠癌细胞的侵袭能力，而miRNA-15a的下调或缺失会导致抗凋亡基因bcl2的表达量升高，引起淋巴瘤和白血病的发生[5]。本研究通过对膀胱癌组织和T24细胞株的研究，探讨miRNA-217对T24细胞增殖、侵袭、迁移的影响及其可能的作用机制，为临床治疗膀胱癌提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年12月至2018年4月于我院接受手术治疗的80例膀胱癌患者癌组织及距离癌组织超过2 cm处的正常组织，用以上组织构建膀胱癌组织芯片。在免疫组织化学染色后有16例组织标本出现不同程度缺失，其余64例标本经组织病理学检测证实为原发性膀胱癌，并纳入研究。其中男28例，女36例；年龄40～75岁，平均年龄(54.01±6.21)岁；术前患者均未进行放化疗。所有患者同意本研究并签署知情同意书，且经我院伦理委员会审核批准后收集标本。

1.2 材料 人源膀胱癌细胞株T24购自上海博古生物技术有限公司。慢病毒过表达载体RSK4-miRNA-217、阴性对照RSK4-NC及miRNA-217、U6引物均由上海吉玛制药技术有限公司设计完成。DMEM培养基(D777)、蛋白定量试剂盒于TOYOBO采购；Trizol reagent(9009)采购自TaKaRa；ECL化学发光试剂盒购自美国 Advansta、Transwell小室采购自BD；抗体购自碧云天有限公司；10～12周无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级雄性 SD 大鼠，体重200～230 g，购自北京维通达生物技术有限公司[生产许可证号：SYXK(京)2017-005]，裸鼠实验遵循动物保护和做好动物福利规定，并经实验动物伦理委员会批准。苏净Airtech超净工作台；三洋 MCO-15AC细胞培养箱；尼康 Ti-U/Ti-s倒置荧光显微镜；艾本德5810R 型高速离心机；罗氏 R480实时荧光定量PCR仪；蔡司LSM710共聚焦激光扫描显微镜。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR:采用Trizol法提取各组细胞及组织中总RNA并进行反转录，按照PrimeScrip反转录试剂盒进行反转录成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq说明书配置PCR反应体系，反应过程:①预变性：75℃，120 s；②变性：90℃，5 min；③退火：60℃，60 s；④延伸72℃，30 s；⑤PCR仪采集荧光信号40个循环，每个样本独立重复实验5 次。U6作为内参(上游引物为5’-AACAGAGATGAGCCTTGTGC-3’，下游引物为5’-CGTACGTAGTCGAACCGAGA-3’)， 目的基因miR-217(上游引物为5’-CCATATCGCTGGATGACGAT-3’，下游引物为5’-GCCGTGGGGTGTTCAATACT-3’)，Jagged-1的mRNA(上游引物为 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物为 5’AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)，目的基因相对表达量用2-ΔΔCT表示；每个样本独立重复测量3次。

1.3.2 细胞培养及转染:将T24细胞接种于含有灭活的10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于生化培养箱中培养，条件37℃，5%CO2，当细胞生长密度达85%时，胰蛋白酶消化传代。取对数生长期细胞进行转染，调整膀胱癌T24细胞株浓度至1×106个/ml，采用Lipofectamine 2000将浓度均为100 nmol/L的RSK4-miRNA-217和RSK4-NC慢病毒载体转染至细胞，细胞分为RSK4-miRNA-217组、RSK4-NC组以不转染的T24细胞作为空白对照组。

1.3.3 CCK-8及平板克隆实验检测miR-217对T24细胞增殖的影响:将各组按照每孔500～1 000个密度铺至96 孔板，轻轻混匀后，置入37℃培养箱继续培养，细胞继续培养0、24、48、72、96 h，每孔加CCK-8 10 μl，37℃避光4 h 后，弃掉孔内液体，再加DMSO各100 μl，置于37℃摇床上快速振荡15 min，以便充分溶解结晶物，最后将96 孔板置于酶标仪上检测 450 nm 处的OD值。将上述2种稳转细胞按每孔5 000个密度铺6孔板继续培养，隔周更换新鲜培养液，2周后用考马斯亮蓝染色，记录菌落形成数量。

1.3.4 裸鼠皮下荷瘤模型:调整细胞浓度，以1×105个/孔接种于96孔培养板中，分组处理同上，轻轻混匀后，置入37℃培养箱继续培养，待生长密度达到1×106个/ml时，消化细胞，200 r/min离心5 min，弃掉上清液，加入500 μl PBS缓冲液，避光放置于冰上，同时备好2 ml注射器。4周雄性裸鼠，随机分为3组，每组6只。用10%的水合氯醛将已经禁食12 h的SD大鼠麻醉后(每组6只)，将1 ml细胞悬液注射进裸鼠右前肢下部皮肤。接种第5天后能观察到原位肿瘤。同时使用活体成像系统(IVIS)来检测生物信号强度(备注：检测前10 min，需以150 mg/kg剂量腹腔注射Luciferin)。7 d后裸鼠皮下成瘤，之后每隔3 d用游标卡尺测1次移植瘤长径(a)和短径(b)，并计算肿瘤体积(V)=ab2/2，绘制肿瘤生长曲线。

1.3.5 生物信息学预测及双荧光素酶报告基因验证miR-217和PI3K的关系:根据www.microRNA.org网站预测miR-217和PI3K的结合片段。采用PCR扩增含有miR-217、PI3K结合位点的Dicer1片段，并将扩增的该片段插入荧光素酶载体psi-CHECK中，构建野生型质粒psi-CHECK-PI3K-wild，同时将结合片段中的核苷酸进行基因突变，并构建突变型质粒psi-CHECK-PI3K-mutant。将miR-217及阴性对照分别与野生型质粒psi-CHECK-PI3K-wild和突变型质粒psi-CHECK-PI3K-mutant共转染至293FT细胞，以空载质粒做为对照。24 h后，根据双荧光素酶检测试剂盒说明书测定荧光素酶活性，萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶活性值即为报告基因活性。

1.3.6 Western blot检测:调整细胞浓度，按1×105个/孔接种于6孔培养板中，分组处理同上，置入5%CO2、37℃培养箱12 h，加入裂解液，常规方法提取各组细胞中的FRY和NRP1，BCA测定蛋白含量，取50 μg 蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳结束后，转至PVDF膜，封闭，加入相应一抗(1∶2 000)，维持4℃过夜孵育，次日PBS漂洗，加入二抗(1∶5 000)，PBS漂洗，ECL显色。Image Quant软件扫描并分析相应蛋白的灰度值，用GAPDH为内参蛋白，来计算目标蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 膀胱癌组织和正常组织中miRNA-217、PI3K、p-AKT和E2F3表达 qRT-PCR结果显示，miRNA-217在膀胱癌组织中的表达明显高于正常组织(P<0.05)；Western blot检测结果显示P13K/AKT信号通路中PI3K、P-AKT及E2F3蛋白在膀胱癌组织表达明显高于正常组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1。

表1 miR-217、PI3K、p-AKT和E2F3相对表达量

图1 miRNA-217、PI3K、p-AKT和E2F3在膀胱癌组织和正常组织表达

2.2 细胞系构建 qRT-PCR结果显示，空白对照组、RSK4-NC组和RSK4-miRNA-217组细胞中miRNA-217的相对表达量分别为0.97±0.18、1.02±0.10和1.82±0.15，与空白对照组和RSK4-NC组比较，RSK4-miRNA-217组细胞中miRNA-217的表达量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，空白对照组和RSK4-NC组miRNA-217的表达差异无统计学意义(P>0.05)，提示成功构建miRNA-217过表达细胞系。

2.3 CCK-8检测miRNA-217对细胞增殖能力的影响 CCK-8实验结果显示，与空白对照组和RSK4-NC组比较，RSK4-miRNA-217组细胞OD450明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；平板克隆实验结果显示，过表达miRNA-217后，RSK4-miRNA-217组细胞克隆数明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；空白对照组和RSK4-NC组细胞增殖和细胞克隆数差异无统计学意义(P>0.05)。见图2，表2。

图2 平板克隆实验检测细胞增殖

表2 miRNA-217对T24细胞增殖能力的影响

2.4 裸鼠皮下成瘤能力 空白对照组、RSK4-NC组和RSK4-miRNA-217组移植瘤体积分别为(20.02±1.53)mm3、(21.12±1.60)mm3和(46.65±3.25)mm3，与空白对照组和RSK4-NC组比较，RSK4-miRNA-217组细胞移植瘤体积明显增大，差异有统计学意义(P<0.05)；空白对照组和RSK4-NC组细胞间差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.5 miR-217和PI3K关系预测及验证 经www.

图3 miRNA-217对裸鼠皮下成瘤能力增殖能力的影响

microRNA.org网站预测发现miR-217和PI3K之间有互补结合序列，提示两者具有靶向调控关系。双荧光素酶报告实验显示，miR-217能显著抑制野生型psi-CHECK-PI3K-wild的荧光素梅活性(P<0.05)，而对突变型psi-CHECK-PI3K-mutant的荧光素酶活性无影响(P>0.05)。说明miR-217能特异性结合PI3K。见图4，表3。

图4 www.microRNA.org网站预测miR-217和PI3K的结合位点

表3 双荧光素酶报告基因检测结果

2.6 miRNA-217对T24细胞PI3K、p-AKT、E2F3表达的影响 Western blot 结果显示，与空白对照组和RSK4-NC组比较，RSK4-miRNA-217组细胞PI3K、p-AKT、E2F3蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，在空白对照组和RSK4-NC组细胞中差异无统计学意义(P>0.05)。见表4，图5。

表4 PI3K、p-AKT和E2F3在T24细胞中相对表达量

3 讨论

膀胱癌因其发病位置比较隐蔽，不容易检查，且早期症状复杂，缺少明显的特征，所以往往被忽视，导致诊断和治疗延误，所以确诊时一般多属癌症中期或者晚期，已经不能进行手术切除或者局部放疗，且其预后较差[6]，给患者的家庭和社会均带来沉重的负担。因此从分子生物学角度出发寻找其进展和转移的标志物，对于患者选择合适的治疗方法和预后指标的判定有着重要的意义。

图5 miRNA-217过表达后T24细胞中PI3K、p-AKT和E2F3表达

目前，microRNAs已被发现广泛分布于多个物种中，1个microRNA在同一物种的单一细胞类型中可调控多个功能靶标，多个microRNAs则可竞争或协同靶向调控1个mRNA[7]。此外，miRNAs在多种肿瘤中表达异常，且在肿瘤的增殖、凋亡、侵袭及转移过程中，通过调控癌基因或抑癌基因间接参与癌细胞生物学进程[8]。miRNA-217位于染色体lp36.2上，全长95个核苷酸，Nakashima等[9]报道miRNA-217诱导骨肉瘤细胞通过Wnt/β-catenin途径增殖并增强转移。但其他研究表明，miRNA-217抑制肿瘤细胞转移，miRNA-217通过抑制环氧合酶-2抑制肿瘤的增殖侵袭[10]。miRNA-217通过抑制前列腺癌细胞侵袭蛋白1抑制肿瘤增殖侵袭[11]。miRNA-217通过靶向三阴性乳腺癌中的偏二氢吡啶抑制肿瘤的增殖和转移[12]，miRNA-217在肿瘤转移中的不同作用，可能取决于肿瘤和组织类型[13]。本研究结果显示膀胱癌组织中miRNA-217表达水平明显高于正常组织，提示miRNA-217在膀胱癌的发生发展中可能起着重要作用。为了进一步研究miRNA-217在膀胱癌中的作用，本研究构建了miRNA-217过表达细胞系，结果显示LmiRNA-217上调后，促进了膀胱癌细胞T24的增殖和侵袭能力。

miRNA-217对不同肿瘤有不同靶标，这些不同靶标发挥不同作用。例如，miRNA-217通过靶向Serbp1抑制乳腺癌细胞增殖[14]，通过靶向α5整合素促进人肝癌细胞的失活[15]，通过抑制Zeste同源物的增强子抑制人肝细胞癌上皮间充质转化[16]。研究表明，P13/AKT信号通路在各种类型的癌症中会异常激活，与肿瘤细胞的生存、增殖和侵袭过程可能息息相关[17]。几项研究表明miRNA可以通过靶向P13/AKT信号通路调控肿瘤发生。例如，miR-1246通过靶向P13促进食管癌转移[18]，miR-1303通过靶向P13促进神经母细胞瘤的细胞增殖[19]。本研究经www.microRNA.org网站预测发现miRNA-217和P13K有互补结合序列，双荧光素酶报告实验证实两者的靶向结合关系。PI3K也介导miRNA对化疗的耐药性和转移的影响[20]。E2F3是P13/AKT信号通路下游重要蛋白，参与细胞分化、增殖以及侵袭等生物反应过程[21]。E2F3作为一种细胞周期关键蛋白，在细胞周期的调控过程中发挥重要作用，并参与体内主要两条细胞增殖调节和肿瘤监控途径的表达[22]。本研究结果显示miRNA-217过表达组PI3K、P-AKT和E2F3表达均上调，说明PI3K受 miRNA-217靶向调控，功能性P-AKT表达增多，促进E2F3蛋白表达。

综上所述，miRNA-217促进了膀胱癌细胞癌细胞增殖、侵袭和转移，其作用机制可能是miRNA-217通过靶向P13/AKT信号通路调控E2F3表达实现的。