牛乳中乳过氧化物酶活性的影响因素

花榜清

（乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436）

乳过氧化物酶是哺乳动物血红素过氧化物酶家族的一员[1]，存在于哺乳动物的分泌液中，如乳汁、唾液、泪液等[2]。乳过氧化物酶是一种分子质量约80 kDa的单体糖蛋白[3]，主要通过过氧化氢催化硫氰酸根离子的氧化，从而生成具有广泛抗菌活性的反应产物[4-6]，不同哺乳动物乳汁中的乳过氧化物酶含量不同。乳过氧化物酶还参与机体免疫防御[7-9]，降低某些癌症风险[10-11]，在医药行业的应用上具有较大潜力。

乳过氧化物酶是牛乳中天然存在的酶，对热的敏感性使其成为牛乳和乳制品热处理是否过度的重要指标。原料乳中含有很多致病微生物，通过合适、有效的热处理确保牛乳在保质期内没有病原微生物至关重要[12]。 合适的巴氏杀菌工艺应在有效杀灭病原性微生物的同时，产生最低程度的化学、物理及感官变化，最大程度保证营养物质不被破坏。过强的热处理往往会使牛乳中活性营养素失活，降低牛乳本身的营养价值[13]。乳过氧化物酶是牛乳中热稳定性相对较强的酶，在巴氏杀菌（72 ℃、15 s）条件下，耐热球菌、结核杆菌和大肠杆菌等病原性微生物被灭活的同时，乳过氧化物酶只会损失20%～30%的活性，并不会完全失活[14]。因此，乳过氧化物酶活性可以体现巴氏杀菌过程中是否存在过度热加工、热处理等现象，是乳品加工业一个非常重要的指标。

除了热处理能有效杀灭病原菌外，早在1987年， Piot等[15]就将无机膜用于全脂牛乳的过滤除菌，并取得了良好的效果。由于牛乳中脂肪粒径与细菌大小较接近，单用膜过滤进行除菌不能满足商业化生产，因此目前采用的技术是先将乳脂肪分离出来，将脱脂乳进行膜过滤除菌，分离后的稀奶油单独进行热处理杀菌，最后将二者混合，该工艺的除菌率可以达到99.8%～99.9%，同时能保留更多的热敏感性营养物质[16]。

本研究采用ISO/TS 17193：2011《乳过氧化物酶活性测定 光度法》[17]测定不同杀菌工艺的牛乳中乳过氧化物酶活性，并探究牛乳中乳过氧化物酶活性在不同贮藏温度、时间下的变化，为乳品行业中更高品质的鲜乳加工开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛乳样品 光明牧业申丰牧场。

二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；质量分数30%过氧化氢溶液（分析纯） 天津市天力化学试剂有限公司； 2,2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）（生物技术级） 上海麦克林生化科技有限公司；实验室用水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

GNP-9270隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；TE612-L电子天平 美国Sartorius公司；Avanti J-301高效离心机 美国Beckman Coulter有限公司； pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Specord 205紫外分光光度计 德国耶拿公司。

1.3 方法

1.3.1 缓冲溶液的配制

将0.72 g二水磷酸氢二钠和3.99 g磷酸二氢钾置于烧杯中，加入约450 mL去离子水溶解，调节溶液pH值至6.00±0.03，将溶液转移至500 mL容量瓶中，加去离子水定容。

1.3.2 过氧化氢溶液的配制

吸取100 µL质量分数30%的过氧化氢溶液至100 mL容量瓶中，定容。

1.3.3 ABTS溶液的配制

称取55 mg ABTS于50 mL容量瓶中，加入约30 mL上述缓冲溶液溶解，再添加1.0 mL上述过氧化氢溶液，用上述缓冲溶液定容。

1.3.4 不同杀菌工艺对牛乳中乳过氧化物酶活性的影响

取原料乳，分别经75、85、125 ℃加热15 s的杀菌工艺以及低温陶瓷膜过滤工艺处理，冷却后冷藏备用。分别测定原料乳和经不同杀菌工艺处理后样品的乳过氧化物酶活性。

1.3.5 浓缩或脱脂工艺对牛乳中乳过氧化物酶活性的影响

取原料乳进行蒸发浓缩，再经75 ℃、15 s热处理，冷却后冷藏备用；取原料乳进行离心脱脂，再经75 ℃、15 s热处理，冷却后冷藏备用。分别测定原料乳和经不同浓缩或脱脂工艺处理后样品的乳过氧化物酶活性。

1.3.6 贮藏温度和时间对牛乳中乳过氧化物酶活性的影响

分别取3 份原料乳，经75 ℃、15 s热处理后分别放置于5、20、30 ℃条件下，再分别取不同温度下放置0、6、12、24、48、72、96、168、240 h的样品，测定乳过氧化物酶活性。

1.3.7 牛乳样品稀释液的制备

将待测牛乳样品恢复至室温，加入一定比例的水稀释。其中将原料乳用水稀释40 倍，鲜牛乳稀释20 倍，高温灭菌乳和超高温灭菌乳不稀释。

1.3.8 牛乳中乳过氧化物酶活力的测定

取2 mL 2 mmol/L ABTS溶液至塑料比色皿中，盖上盖子，置于25 ℃水浴锅中，添加50 µL稀释后的牛乳样品，立即盖上比色皿并混合，快速放入已经预热至25 ℃的分光光度计中，15 s内测定420 nm波长处的吸光度（A1），2 min后再次记录吸光度（A2）。牛乳中乳过氧化物酶活力按式（1）计算。

式中：V1为总待测体积（2.05 mL）；V2为牛乳样品体积（0.05 mL）；ε为摩尔吸光系数（ε=43.2 L/（mol·cm））； d为比色皿的路径长度（1.0 cm）；n为稀释倍数；1 000为换算系数；2为化学计量系数。

1.3.9 牛乳中乳过氧化物酶活性损失率计算

牛乳中乳过氧化物酶活性损失率按式（2）计算。

式中：a1为生乳中乳过氧化物酶活力/（U/L）； a2为经过不同工艺处理后样品中乳过氧化物酶活力/（U/L）。

1.4 数据处理

运用Excel软件对实验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同杀菌工艺牛乳中乳过氧化物酶活性

实验结果表明，原料乳经85 ℃或125 ℃加热15 s后几乎检测不到乳过氧化物酶活性，而经75 ℃加热15 s以及低温陶瓷膜过滤处理后的牛乳均能检测出较强的乳过氧化物酶活性。

由图1可知，经低温陶瓷膜过滤处理的牛乳乳过氧化物酶活性损失率明显小于经75 ℃、15 s巴氏杀菌处理的牛乳，能保留更多的热敏感性物质。

2.2 经浓缩或脱脂工艺后牛乳中乳过氧化物酶活性

由图2可知，直接进行75 ℃、15 s巴氏杀菌后的全脂牛乳中乳过氧化物酶活性损失率集中在61%～65%，原料乳经降膜浓缩再进行75 ℃、15 s巴氏杀菌后的浓缩牛乳的乳过氧化物酶活性损失率集中在61%～65%和66%～70%，原料乳经部分脱脂或全部脱脂再进行75 ℃、15 s巴氏杀菌后的减脂牛乳的乳过氧化物酶活性损失率更多集中在71%～75%，可能过多的工艺流程会增加牛乳中乳过氧化物酶的损失。另外，零脂牛乳的乳过氧化物酶活性损失率在71%～75%的样品数更多，这可能是由于乳脂离心过程中有部分乳过氧化物酶处于脂肪层，表明同样的热处理条件下，随着工艺步骤增多，乳过氧化物酶的活性会有所降低。

图2 经浓缩或脱脂工艺处理后牛乳中乳过氧化物酶活性损失率变化Fig. 2 Change of lactoperoxidase activity in milk after concentration or defatting

2.3 贮藏温度和时间对牛乳中乳过氧化物酶活性的影响

经过对样品的气味和外观观察发现：巴氏杀菌乳5 ℃条件下贮藏10 d未出现明显的气味和性状改变；20 ℃条件下贮藏5 d时有轻微异味，未发现明显结块；30 ℃条件下贮藏5 d时有轻微异味和少量结块。原料乳在5 ℃条件下贮藏10 d时出现轻微异味，部分结块；20 ℃条件下贮藏3 d时就出现了轻微异味，同时有白色絮状悬浮物，贮藏5 d时，则有较强烈的异味同时结块变多，甚至有凝固现象；30 ℃条件下贮藏2 d时就出现了轻微异味同时伴有少量结块。

图4 贮藏温度和时间对巴氏杀菌乳中乳过氧化物酶活力的影响Fig. 4 Effect of storage temperature and time on the activity of lactoperoxidase in pasteurized milk

由图3～4可知，牛乳在不同贮藏温度下，乳过氧化物酶活力变化较大，随着贮藏时间的延长，乳过氧化物酶活力逐渐降低，牛乳中的微生物逐渐繁殖直至牛乳发生变质，无法食用。由于原料乳本身含有较多的微生物，因此在相同贮藏温度下更容易变质，同时乳过氧化物酶活力降低也更快。因此，乳过氧化物酶的活性也能间接反映牛乳中微生物的生长状况。原料乳和巴氏杀菌乳乳过氧化物酶活力在贮藏24 h内都出现了下降后上升的现象，这与Fonteh等[18]的研究结果一致，但具体的原因尚未明确，可能与乳过氧化物酶同工酶的存在有关系。

图3 贮藏温度和时间对原料乳中乳过氧化物酶活力的影响Fig. 3 Effect of storage temperature and time on the activity of lactoperoxidase in raw milk

3 结 论

近年来，随着我国现代物流业的迅速发展及冷链的逐渐完善，人们的生活水平与消费水平也在不断提高，从最初追求牛乳的香浓与口味再到现在逐渐回归牛乳的自然属性而更加倾向于选择风味新鲜和奶味纯正的巴氏杀菌乳。巴氏杀菌乳是采用低温巴氏杀菌法加工而成的产品，既能够达到安全的饮用标准，又能较好保留原料乳中的营养物质和风味，从而广受消费者的喜爱[19-21]。

通过研究不同工艺下乳过氧化物酶的活性发现，经85 ℃或125 ℃加热15 s后的牛乳几乎检测不到乳过氧化物酶活性，而经75 ℃加热15 s以及低温陶瓷膜过滤处理后的牛乳均能检测出较强的乳过氧化物酶活性，经低温陶瓷膜过滤处理后的牛乳中乳过氧化物酶活性损失率更低。原料乳经部分脱脂或全部脱脂再进行75 ℃、15 s巴氏杀菌后样品中的乳过氧化物酶活性损失率比未经过脱脂的样品更高；经巴氏杀菌处理后的牛乳中乳过氧化物酶活性在低温贮藏条件下更易保留。

本研究通过测定不同工艺及不同贮藏条件下牛乳中乳过氧化物酶活性变化，为巴氏杀菌乳的品质提升提供一定的参考，从而为消费者带来更好的产品。