牛初乳与牛常乳中游离氨基酸和不溶性蛋白质氨基酸对比研究

宋婉莹，李墨翰，张秀敏，杨 梅，岳喜庆,，郑 艳,

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.北京食品科学研究院，北京 100068）

母乳是婴幼儿成长最天然、健康、完全的理想食物，营养丰富且均衡，比牛乳、羊乳等其他乳源更加利于消化吸收，适合于婴幼儿胃肠道功能尚不成熟、所含消化酶不完全的特点[1]。世界卫生组织提倡在婴儿分娩后1 h即开始进行并坚持6 个月纯母乳喂养，但据国家卫生和计划生育委员会的统计显示，我国0～6 个月婴儿的纯母乳喂养率仅为27.8%[2]。因此，以母乳为“金标准”设计的婴幼儿配方乳粉是替代母乳的最佳选择。

牛乳作为使用最为广泛的配方乳基料，物美价廉，营养丰富，同时含有人体所需的氨基酸、乳蛋白、乳脂肪、丰富的矿物质和维生素等成分[3]。牛乳中天然存在有许多生物活性成分，包括具有抑菌效果的酪蛋白以及酪蛋白来源的生物活性肽，如可以缓解兴奋、焦虑的阿片肽等，还包括各种生长因子、激素、核苷酸、溶菌酶、细胞因子等，是人类天然的保健食品[4]。现代药理学相关研究表明，牛乳有抗菌、抗氧化、增强机体免疫力、提高记忆力等作用[5]。虽然牛乳所富含的蛋白质不仅可为人类生理活动提供能量与必需氨基酸，还具有较高的营养价值和功能特性，但大量的研究结果显示，由于牛乳和人乳蛋白及氨基酸成分上的差异性[6]，常会导致过敏性哮喘、鼻炎、皮肤湿疹、消化功能紊乱等疾病[7]，据报道，约3%的成年人经历过乳制品过敏[8]。因此，详细表征不同泌乳期牛乳成分的差异，有助于以牛乳为基料的配方乳粉的精细化研发，并为乳制品的多样化生产提供原料和技术基础。

乳中的氨基酸不仅构成蛋白质，而且在人体中也起着重要作用。研究表明，乳中的氨基酸能够调节机体生命活动[9]、提高免疫力[10]，同时参与合成各种生物活性物质[11]。氨基酸按照营养学分类可分为必需氨基酸和非必需氨基酸。必需氨基酸指人体（或其他脊椎动物）不能合成或合成速度远不能适应机体需要，需由食物蛋白质供给的氨基酸[12]。对成人而言，必需氨基酸有8 种，即赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸[13]。另外，组氨酸为婴幼儿所必需，而精氨酸、胱氨酸、酪氨酸、牛磺酸为早产儿所必需。上述必需氨基酸必须从食物中直接获得，否则不能维持机体的氮平衡并影响健康[14]。非必需氨基酸指人体可以通过自身合成或从其他氨基酸转化得到，不一定从食物中摄取[15]。这类氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸等。有些非必需氨基酸，如胱氨酸和酪氨酸如果供给充裕还可以减少必需氨基酸中蛋氨酸和苯丙氨酸的需要量[15]。氨基酸按照其存在部位的不同又可以分为游离氨基酸和不溶性蛋白质氨基酸。游离氨基酸指以游离态存在的单个氨基酸分子，可被直接吸收利用；而不溶性蛋白质氨基酸则需要通过酸解，将待检产品中的蛋白质、多肽等氨基酸链水解成单个氨基酸，因此，水解氨基酸反映的是产品中所有氨基酸单位（单个或多个）的组成[16]。由于游离氨基酸与蛋白质中氨基酸的结构相同，因此氨基酸又被认为是连接代谢物和蛋白质之间的重要桥梁[17]。

本研究以不同泌乳期的牛乳样品为原料，对牛初乳和牛常乳中游离氨基酸和不溶性蛋白质氨基酸的种类及含量进行表征，并且对比分析其中的差异，进一步完善对于不同泌乳期牛乳氨基酸组成及含量的差异研究，为配方乳粉的研制及婴幼儿营养调配提供更为精确的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛乳样品（牛初乳和牛常乳），采样地点为辽宁省沈阳市某奶牛养殖场，随机选取1～6 月龄的健康荷斯坦奶牛60 头，由该奶牛场的专业养殖人员于每天12—14时人工采样，均为混合乳样，每份混合乳样包含同等比例的3 头奶牛乳样，分别在产后0～7 d内每天采集4 份、共32 份牛初乳，15 d～6 个月每5 d采集1 份，共33 份牛常乳，分别记为牛初乳组和牛常乳组。采集后的样品保存于消毒完毕的50 mL离心管中，四周用干冰覆盖，运回实验室，贮藏于超低温冰箱中（-80 ℃）备用。

氨基酸混合标准品 美国Sigma-Aldrich公司；浓盐酸 深圳市恒利化工有限公司；磺基水杨酸上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

L-8900高效氨基酸分析仪 日本日立高新技术公司；RE-2000A旋转蒸发仪 深圳瑞德仪器设备有限公司；H1650台式高速离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 游离氨基酸的提取

取待测的牛初乳（或牛常乳）样品2 mL于离心管中，按照体积比1∶1加入2 mL 5%磺基水杨酸溶液沉淀蛋白质，用振荡器振荡混匀，1 500 r/min条件下离心20 min，取上清液于新的离心管中，4 ℃冰箱内静置1 h，用0.22 μm水系滤膜过滤，然后装入上样瓶，备用。

1.3.2 水解氨基酸的提取

分别准确吸取牛初乳（或牛常乳）样品2 mL，置于35 mL玻璃水解管内，并加入2 mL浓盐酸，使用真空泵对水解管进行抽真空处理，用酒精喷灯对其封口，在110 ℃条件下水解23 h。待水解管冷却后开管，将水解后得到的溶液倒入旋转蒸发仪中，将样品蒸干，除去浓盐酸后，使用0.02 mol/L盐酸溶液稀释并定容至100 mL，最后再将通过一系列处理得到的溶液通过0.45 μm滤膜过滤，待测。

1.3.3 样品中氨基酸的测定

取样品溶液与0.1%磺基水杨酸溶液以体积比4∶1混匀，置于4 ℃冰箱静置60 min后，10 000 r/min、4 ℃离心5 min，取上清液，经0.22 µm微孔滤膜过滤后经氨基酸自动分析仪测定。色谱条件：分析柱（4.6 mm×60 mm），柱温57 ℃，反应柱温度135 ℃，泵1流速0.45 mL/min，泵2流速0.35 mL/min，进样量20 µL[18-19]。紫外检测器：脯氨酸在440 nm波长处测定吸光度，其他氨基酸在570 nm波长处测定吸光度。

1.4 数据处理

实验所测得的结果均以平均值±标准差表示，利用SPSS 17.0软件对数据进行分析，选择t检验对数据进行显著性分析，依据P值判断差异性，P＜0.05时表示结果差异显著，P＞0.05时表示结果无显著性差异。

2 结果与分析

2.1 牛初乳与牛常乳中游离必需氨基酸的对比分析

游离氨基酸能够被人体直接吸收，其含量和成分能够部分反映食品的营养价值[20]。由表1可知，牛常乳和牛初乳中均含有9 种人体必需氨基酸。牛初乳中游离赖氨酸含量显著高于牛常乳（P＜0.05），牛初乳中其他8 种必需氨基酸含量均极显著高于牛常乳（P＜0.01），特别是游离缬氨酸在牛初乳中含量远远高于其他8 种氨基酸。缬氨酸具有较强的免疫活性，能够促进组织修复，调节机体血糖水平，提供机体所需能量[21]。牛初乳中异亮氨酸含量约是牛常乳的114 倍，异亮氨酸和亮氨酸及缬氨酸混合使用能起到修复肌肉组织、调控血糖、提高体内生产激素产量的作用，是婴儿正常发育所必需的氨基酸[22]。牛初乳中苯丙氨酸含量极显著高于牛常乳（P＜0.01），约为牛常乳的10 倍，苯丙氨酸是典型的生酮生糖氨基酸，是人体必需的芳香族氨基酸，通过羟化反应转化成酪氨酸进行分解利用，因此苯丙氨酸可以在赖氨酸摄入不足时有效补偿，同时避免苯丙氨酸含量过高造成中毒[23]。 赖氨酸在机体内的代谢产物有黑色素、多巴胺、去甲肾上腺素等。苯丙氨酸还是体内合成肾上腺素、甲状腺激素等的前体物质[24-25]。牛初乳中甲硫氨酸含量显著高于牛常乳，甲硫氨酸在体内通过转化成中间产物同型半胱氨酸形成胱氨酸，促进机体正常生长。甲硫氨酸可提供甲基，参与蛋白质、神经递质、激素等的合成以及影响基因的表达过程[26]。色氨酸是维持幼龄动物生长及成人体内氮平衡绝对必需的氨基酸，并且关系到哺乳动物泌乳、繁殖等功能。色氨酸可转变生成烟酸，一旦缺乏就会造成生长停滞、体质量减轻、食欲减退，严重时会导致无法继续维持生命。色氨酸是合成褪黑素及5-羟色胺的前体，这2 种物质可以有效调节睡眠节律，研究显示，添加色氨酸哺育的婴儿在睡眠模式上更加接近母乳喂养的新生儿[27]。亮氨酸在营养物质代谢调节方面，可扮演营养信号的角色，激活翻译过程的起始因子，促进蛋白质合成[28]。在母乳中异亮氨酸、缬氨酸与亮氨酸含量比为1.0∶1.2∶1.8，不合适的含量比将会致使蛋白质合成受到影响，出现生长障碍。牛初乳中游离组氨酸的含量是牛常乳中的8.58 倍，差异极显著。组氨酸与机体组织修复密切相关，在体内代谢产生组胺，调节血管扩张收缩及过敏反应等[29]。

表1 牛初乳和牛常乳中游离必需氨基酸的定量分析结果Table1 Quantitative analysis of free essential amino acids in bovine colostrum and mature milk

2.2 牛初乳与牛常乳中游离非必需氨基酸的对比分析

由表2可知，牛常乳中测得7 种非必需氨基酸，牛初乳测得8 种非必需氨基酸，牛初乳中的游离非必需氨基酸种类更加齐全。其中，牛初乳和牛常乳中游离丝氨酸和 酪氨酸含量差异不显著，其他6 种氨基酸的含量在牛初乳和牛常乳中均存在极显著差异（P＜0.01）。在牛初乳中，游离非必需氨基酸中含量最高的是丙氨酸，可以抑制葡萄糖激酶，调节糖异生和糖酵解途径，改善机体能量代谢。在牛常乳中，游离谷氨酸的含量远远超过其他游离非必需氨基酸，有研究表明，谷氨酸除了可以调节食欲，还会在体内与血氨结合，对于氨的毒害有解除作用，因此能够保护肝脏，预防和治疗肝昏迷。近年来，有证据显示，谷氨酸在抑郁障碍这种慢性精神疾病的发病机制中起重要作用。牛常乳中谷氨酰胺的含量极显著高于牛初乳，通过摄食获取外源谷氨酰胺是保证人体对谷氨酰胺正常需求的有效途径。谷氨酰胺作为一种中性、无毒的物质，容易通过细胞膜，为细胞增殖过程供能，同时不会抑制葡萄糖的利用。谷氨酰胺增加了对肠细胞的屏障作用，有效阻止肠毒素等侵入，保护肠道黏膜。肾脏通过增加摄入谷氨酰胺、排泄尿氨，缓解酸中毒，维持酸碱平衡。谷氨酰胺参与了γ-氨基丁酸和谷氨酸的代谢，与中枢神经系统的兴奋、抑制状态有关。对于婴幼儿而言，母乳中丰富的游离谷氨酰胺足以提供生长所需要的量[30]。

表2 牛初乳和牛常乳中游离非必需氨基酸的定量分析结果Table2 Quantitative analysis of free non-essential amino acids in bovine colostrum and mature milk

牛初乳中甘氨酸含量约是牛常乳的3 倍，含量差异显著。甘氨酸是结构最为简单的蛋白质氨基酸，作为一种神经递质在体内与胆汁酸结合，在中枢神经系统中参与信号传递过程，同时参与合成谷胱甘肽、嘌呤碱等含氮物质。研究表明，早产儿对甘氨酸的需求量较高，母乳无法供给充足甘氨酸供生长发育所需[31]。牛初乳相较于牛常乳所独有的游离氨基酸是脯氨酸，脯氨酸参与伤口愈合、细胞内自由基清除等许多反应，对DNA的甲基化和转录过程会有影响。研究发现，哺乳期妇女乳腺中的精氨酸可以合成脯氨酸，通过母乳喂养满足新生婴幼儿对脯氨酸的需求[32]。

2.3 牛初乳与牛常乳中不溶性蛋白质必需氨基酸的对比分析

由表3可知，牛初乳和牛常乳中均含有7 种水解必需氨基酸，其中，赖氨酸和苏氨酸的含量存在极显著差异（P＜0.01），其余5 种氨基酸含量差异不显著。牛常乳中赖氨酸含量约为牛初乳的2 倍。赖氨酸是谷物类食品的主要限制性氨基酸，牛乳中总赖氨酸在总氨基酸（包括游离氨基酸和不溶性蛋白质氨基酸）含量中占比较高[10]。赖氨酸与人体中枢神经、免疫、发育密切相关[11]，缺乏会引起机体造血功能障碍、食欲减退、代谢紊乱，出现体质量下降、贫血、儿童发育不良、智力低下等症状[33]。研究表明，补充一定剂量的赖氨酸可提高钙的吸收及其在体内的积累，加速骨骼生长、增强免疫力、提高智力、促进发育[34]，同时赖氨酸可直接进入脑组织，影响呼吸链，为神经细胞的修复和进行正常生理活动提供必要的能量来源[35]。牛初乳中苏氨酸含量接近牛常乳的1.5 倍，有研究显示，新生儿对氨基酸液提供的苏氨酸吸收量多于来自母乳的苏氨酸[36]。苏氨酸在胃肠道内起到促进黏蛋白形成的作用，缺乏时会引起腹泻。另外，在牛初乳与牛常乳不溶性蛋白质必需氨基酸中，组氨酸含量均较高且两组之间无显著差异。组氨酸具有促进铁吸收[37]、修复脑损伤等生理功能[38]，对婴儿而言是必需氨基酸。

表3 牛初乳和牛常乳中不溶性蛋白质必需氨基酸的定量分析结果Table3 Quantitative analysis of essential amino acids of insoluble proteins in bovine colostrum and mature milk

2.4 牛初乳与牛常乳中不溶性蛋白质非必需氨基酸的 对比分析

由表4可知，牛初乳和牛常乳中均测得10 种不溶性蛋白质非必需氨基酸，其中甘氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸含量差异不显著，牛初乳中其他4 种氨基酸，即精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、丙氨酸的含量显著高于牛常乳（P＜0.05）。精氨酸是尿素循环中的关键一环，对氨解毒起重要作用，且在体内一氧化氮合成酶的作用下可生成内源性一氧化氮，是血管扩张过程中的信号分子[39]。此外，精氨酸可以促进氧化磷酸化过程，由于婴儿体内精氨酸的更新速率很高，精氨酸摄入不足易引发小肠结肠炎、持续肺动脉高压等新生儿疾病[40]。半胱氨酸是结构中含有巯基的含硫氨基酸，硫作为细胞所需的重要元素，有增加膜稳定性的作用。半胱氨酸在体内不稳定，极易转化生成不溶性的胱氨酸[41]。半胱氨酸是合成牛磺酸、谷胱甘肽等生物活性物质的前体分子，其中，由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的三肽谷胱甘肽是存在于细胞内的抗氧化物质[42]。牛初乳和牛常乳中不溶性蛋白质氨基酸的差异将为不同日龄婴幼儿配方乳粉的研发提供理论依据与数据支持。

表4 牛初乳和牛常乳中不溶性蛋白质非必需氨基酸的定量分析结果Table4 Quantitative analysis of non-essential amino acids of insoluble proteins in bovine colostrum and mature milk

3 结 论

牛初乳和牛常乳中9 种游离必需氨基酸中，含量最高的均为缬氨酸。牛初乳中赖氨酸含量显著低于牛常乳，其他8 种氨基酸在牛初乳中的含量均显著高于牛常乳。牛初乳中有2 种非必需氨基酸未检出，分别是天冬氨酸和半胱氨酸，牛常乳中除了天冬氨酸、半胱氨酸外，脯氨酸也未检出，因此牛初乳中游离状态的非必需氨基酸种类更齐全。在检出的游离非必需氨基酸中，含量最高的是谷氨酸。牛初乳中精氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量显著高于牛常乳，而牛常乳谷氨酸、谷氨酰胺含量显著高于牛初乳。牛初乳和牛常乳中不溶性蛋白质氨基酸中均含有7 种必需氨基酸，亮氨酸未检出，其中，缬氨酸含量最高。牛初乳中赖氨酸含量显著低于牛常乳，苏氨酸含量显著高于牛常乳，其余6 种氨基酸含量差异不显著。牛初乳和牛常乳中均含有10 种不溶性蛋白质非必需氨基酸，天冬酰胺未检出，其中，谷氨酸含量最高。牛初乳中所含精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、丙氨酸含量显著高于牛常乳，其他6 种含量差异均不显著。

本研究对牛初乳和牛常乳中的游离必需氨基酸、游离非必需氨基酸、不溶性蛋白质必需氨基酸、不溶性蛋白质非必需氨基酸进行定性和定量测定分析，比较不同泌乳期牛乳中氨基酸的含量差异。研究结果可以进一步帮助理解泌乳期对牛乳中氨基酸的影响，完善对于牛初乳和牛常乳中氨基酸成分及含量的差异研究，为配方乳粉的研制及婴幼儿营养调配提供更为精确的理论依据。