lncRNA RAB30-AS1对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡影响的机制研究

万淑琼 鲍群丽 黄耿 姜艳萍 张青冬 王楚平

1鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院妇科 435000；2鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院检验科 435000；3鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院泌尿外科 435000

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率近年来持续上升，威胁女性健康［1］。宫颈癌的发生是正常宫颈上皮细胞由增生到癌变的复杂过程，发病因素包括早婚、多产及病毒感染等［2］。深入探究宫颈癌发病相关分子机制对宫颈癌的防治具有重要意义。长链非编码RNA（lncRNA）无蛋白编码功能，是一类长度大于200个核苷酸的RNA［3-5］。lncRNA在转录调控、端粒维护、DNA与蛋白结合等生物学过程中起到重要作用，影响细胞的行为和功能，与各种疾病的发生显著相关［6-8］。既往大量研究表明，lncRNA在宫颈癌中表达上升或降低，参与调节宫颈上皮细胞的恶性转化［9］。RAB30-AS1是一个尚未被报道的lncRNA，由607个核苷酸构成。本研究探究RAB30-AS1对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 宫颈癌细胞Hela购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；DMEM培养基购于美国Gibco公司；荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒购于大连宝生物公司；pcDNA-NC质粒和pcDNA-RAB30-AS1质粒购于上海碧云天生物技术有限公司；Edu试剂盒和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶细胞凋亡试剂盒购于上海生工生物工程股份有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒购于南京建成生物工程有限公司；Lipofectamine 3000购于美国Life Technologies公司；一抗和辣根过氧化物酶标记的二抗购于美国CST公司。

1.2 细胞培养和转染 将Hela细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，培养条件为37℃、体积分数5%CO2。取对数生长期Hela细胞，分别将pcDNA-NC质粒和pcDNA-RAB30-AS1质粒转染至Hela细胞，分别命名为NC组和RAB30-AS1组，转染过程参照Lipofectamine 3000试剂说明书进行。

1.3 qRT-PCR检测RAB30-AS1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5（GPC5）mRNA表达 收集各组Hela细胞，Trizol法提取RNA，应用超微量分光光度计检测RNA浓度，反转录合成cDNA。qRT-PCR反应体系为20μl，以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算RAB30-AS1、GPC5 mRNA的表达。引物序列如下，GPC5引物正向序列：5’-TCTAATATCTCGAAATGCGGCTG-3’，反 向 序 列：5’-GGCCATGTTCCTGTAGGTACTG-3’；RAB30-AS1引物正向序列：5’-GAAGACAAGAGGGCCCTAG-3’，反向序列：5’-AAGCAATGGGCGACAGAC-3’；GAPDH引物正向序列：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反 向 序 列：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.4 Edu试验检测Hela细胞增殖情况 调整两组Hela细胞浓度并接种于激光共聚焦培养皿，加入Edu染料A液孵育5 h；清洗细胞后，加入甲醛固定20 min；清洗细胞后，加入TritonX-100试剂孵育15 min；清洗细胞后，加入Click-iT鸡尾酒反应液避光孵育20 min；清洗细胞后，加入Hoechst 33342试剂避光孵育20 min；清洗细胞后，在激光共聚焦显微镜下计数总细胞数和增殖细胞数，计算细胞增殖率＝增殖细胞数目/总细胞数×100%。

1.5 流式细胞术检测Hela细胞凋亡率 收集两组处于对数生长期的Hela细胞，采用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗3次，加入600μl结合缓冲液，加入10μl Annexin V-FITC，加入10μl PI，在暗室孵育20 min，通过流式细胞仪检测Hela细胞凋亡率。

1.6 蛋白质印迹法（Western blot）检测靶基因蛋白的表达 收集两组处于对数生长期的Hela细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度后，蛋白上样在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中反应，电泳产物转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂牛奶室温下封闭，4℃条件下一抗中孵育过夜，二抗室温孵育2 h。洗膜后，加入电化学发光（ECL）显影液曝光，通过Image J软件分析条带灰度值。

1.7 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组Hela细胞中RAB30-AS1的表达 如图1，Hela细胞转染24 h后，NC组和RAB30-AS1组Hela细胞中RAB30-AS1的 表 达 分 别 为（1.34±0.27）和（8.90±1.60），RAB30-AS1组 相 比NC组 上 调 了6.64倍（t＝4.65，P＜0.01）。

图1 NC组和RAB30-AS1组宫颈癌Hela细胞中RAB30-AS1的表达

2.2 RAB30-AS1对Hela细胞增殖活性的影响 NC组和RAB30-AS1组Hela细胞增殖率分别为（41.82±2.86）%和（20.85±3.82）%，RAB30-AS1组细胞增殖率明显低于NC组（t＝4.39，P＜0.01）；表明RAB30-AS1过表达抑制宫颈癌Hela细胞增殖活性（图2）。

图2 高表达RAB30-AS1对宫颈癌Hela细胞增殖能力的影响

2.3 RAB30-AS1对Hela细胞凋亡率的影响 NC组和RAB30-AS1组Hela细胞凋亡率分别为（12.61±1.96）%和（32.19±4.29）%，RAB30-AS1组细胞凋亡率明显高于NC组（t＝4.16，P＜0.01）；提示RAB30-AS1过表达可促进宫颈癌Hela细胞的凋亡（图3）。

图3 RAB30-AS1对宫颈癌Hela细胞凋亡率的影响

2.4 RAB30-AS1对GPC5 mRNA表达的影响 如图4，NC组和RAB30-AS1组Hela细胞中GPC5 mRNA的表达分别为（1.17±0.11）和（5.72±0.90）；表明RAB30-AS1可促进GPC5 mRNA的表达（t＝5.01，P＜0.01）。

图4 RAB30-AS1对宫颈癌Hela细胞GPC5 mRNA表达的影响

2.5 RAB30-AS1对GPC5蛋白表达的影响 Western blot结果（图5）表明，与NC组相比，RAB30-AS1组Hela细胞GPC5蛋白增加，细胞周期Cyclin H表达降低，促凋亡蛋白Bax表达增加。

图5 高表达RAB30-AS1对宫颈癌Hela细胞GPC5蛋白表达的影响

3 讨 论

lncRNA与前列腺癌、肾癌、宫颈癌等肿瘤细胞的恶性生物学行为显著相关［10-11］。Zhang等［12］报道，lncRNA MIAT在宫颈癌组织和细胞系中表达上调，其能够促进宫颈癌中的细胞增殖、迁移和侵袭，敲低lncRNA MIAT会导致宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭被抑制。Zhou等［13］报道，在宫颈癌中lncRNA EWSAT1的表达增强，并可导致患者的不良预后，下调EWSAT1通过靶向miR-330-5p抑制了宫颈癌Hela细胞的迁移、增殖和侵袭。RAB30-AS1对宫颈癌细胞增殖和凋亡研究未见报道。本研究结果显示，RAB30-AS1过表达后，宫颈癌Hela细胞增殖率显著降低，细胞凋亡率明显增加，提示RAB30-AS1在宫颈癌细胞中表现为抑癌作用。

GPC5蛋白属于Glypican蛋白家族，负责编码细胞表面蛋白聚糖［14］。GPC5蛋白在胰腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等肿瘤表达显著降低，在细胞的恶性转化中发挥重要作用［15-16］。上调GPC5蛋白能够抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、化疗抵抗等恶性生物学行为，GPC5表现为抑癌作用［17］。本研究结果显示，过表达RAB30-AS1后Hela细胞中GPC5基因的表达显著升高，提示RAB30-AS1可促进GPC5基因的表达，GPC5可能是RAB30-AS1的靶基因。RAB30-AS1促进GPC5基因表达后，Hela细胞周期Cyclin H表达降低，促凋亡蛋白Bax表达增加，间接提示Hela细胞增殖活性降低，细胞凋亡增加。

综上所述，RAB30-AS1可能通过上调GPC5基因表达，抑制宫颈癌Hela细胞增殖并诱导细胞凋亡，RAB30-AS1可能成为宫颈癌靶向治疗的新靶点。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。