miR-1277-5p通过调控PHF8对卵巢癌SKOV-3细胞增殖和凋亡的影响

鲍群丽 万淑琼 黄耿 汪宏良 柯俊 尚小玲

1鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院检验科 435000；2鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院妇科 435000；3鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院泌尿外科 435000

卵巢癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，70%的卵巢癌患者确认时已处于晚期，5年生存率较低［1-2］。卵巢癌的高复发率和增殖是导致卵巢癌预后差的主要原因［3］。微小RNA（miRNA，miR）在卵巢癌细胞增殖中的作用及相关研究引起学者广泛的重视［4］。miRNA在卵巢癌组织中的表达水平与肿瘤细胞的恶性生物学行为存在显著相关性［5-6］。研究发现，miR-1277-5p是一种由24个核苷酸组成的miRNA，其在胃癌中发挥抑癌基因作用［7］。miR-1277-5p对卵巢癌细胞增殖和凋亡的作用并不清楚。本研究通过构建miR-1277-5p过表达细胞系，观察miR-1277-5p表达变化对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 卵巢癌细胞SKOV-3购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；McCoy's 5A培养基购于美国Gibco公司；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒购于大连宝生物公司；结晶紫购于美国Sigma公司；对照模拟物、miR-1277-5p模拟物购于上海吉玛制药技术有限公司；Lipofectamine 3000购于美国Life Technologies公司；细胞凋亡试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；一抗和辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G（IgG）二抗购于美国CST公司。

1.2 细胞培养和转染 选择含10%胎牛血清的McCoy's 5A培养基培养SKOV-3细胞，培养条件选择37℃、5%CO2培养箱。按比例将稀释的对照模拟物、miR-1277-5p模拟物与Lipofectamine 3000混合，室温孵育15 min形成复合物，NC组为对数生长期SKOV-3细胞转染对照模拟物，miR-1277-5p组为对数生长期SKOV-3细胞转染miR-1277-5p模拟物。

1.3 qRT-PCR检测miR-1277-5p、PHD锌指蛋白8（PHF8）mRNA表达 TRIzol试剂盒提取NC组和miR-1277-5p组细胞总RNA，逆转录为cDNA，根据qRT-PCR试剂盒说明书扩增，引物序列如下，PHF8引物正向序列：5’-GTGCCGGTGTATTGCCTCT-3’，反 向 序 列：5’-CAACACAACTGCCATGAAACC-3’；甘油醛-3-磷酸脱氢 酶（GAPDH）引 物 正 向 序 列 ：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反 向 序 列：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；miR-1277-5p引物正向序列：5’-TACGTAGATATATATGTATTTT-3’，反向序列：5’-GGTGCCAAGGCTTGCATTCA-3’；RNU6引物正向序列：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，反向序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。以GAPDH和RNU6为内参，采用2-ΔΔCt法分析所得qRT-PCR结果。

1.4 平板集落形成实验检测SKOV-3细胞增殖 使用胰酶消化各组SKOV-3细胞，制成单细胞悬液，每孔1×103个接种至6孔板，培养10 d至肉眼可见集落，使用甲醇溶液固定20 min、0.1%结晶紫染色20 min，拍照并计数集落数量。

1.5 流式细胞术检测SKOV-3细胞凋亡 使用胰酶消化各组SKOV-3细胞，使用1×Binding Buffer缓冲液洗涤1次，加入100μl异硫氰酸荧光素（FITC）试剂到细胞管，加入5μl PI试剂，培养箱内15 min。加入400μl 1×Binding Buffer缓冲液到细胞管，1 h内通过流式细胞仪检测每组细胞凋亡率。

1.6 蛋白质印迹（Western blot）检测PHF8蛋白的表达 使用细胞裂解液提取各组SKOV-3细胞总蛋白，电泳分离蛋白并转膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，使用5%脱脂牛奶进行封闭，加入稀释的一抗4℃孵育过夜，加入IgG二抗室温孵育2 h，使用电化学发光（ECL）显影液进行显影。

1.7 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，两组间比较应用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组SKOV-3细胞中miR-1277-5p的表达 NC组和miR-1277-5p组SKOV-3细胞中miR-1277-5p的表达分别为（1.22±0.42）和（13.22±1.42），miR-1277-5p组相比NC组上调了10.84倍（t=8.12，P＜0.01）。见图1。

图1 NC组和miR-1277-5p组SKOV-3细胞中miR-1277-5p的表达

2.2 miR-1277-5p对SKOV-3细胞增殖的影响 细胞平板集落形成试验显示（图2），NC组和miR-1277-5p组集落形成数分别为（150.70±18.69）个和（67.97±14.82）个，NC组集落的数量高于miR-1277-5p组，差异有统计学意义（t=3.93，P＜0.01），表明miR-1277-5p过表达抑制SKOV-3细胞增殖。

图2 miR-1277-5p对SKOV-3细胞增殖的影响

2.3 miR-1277-5p对SKOV-3细胞凋亡的影响 流式细胞术显示（图3），NC组和miR-1277-5p组细胞凋亡率分别为（6.17±1.63）%和（26.12±2.99）%，NC组凋亡率少于miR-1277-5p组，差异有统计学意义（t=5.86，P＜0.01），表明miR-1277-5p过表达促进SKOV-3细胞凋亡。

图3 miR-1277-5p对SKOV-3细胞凋亡的影响

2.4 miR-1277-5p对PHF8 mRNA表达的影响 如图4，本研究通过RNAhybrid预测miR-1277-5p的靶基因可能是PHF8。NC组和miR-1277-5p组SKOV-3细胞中PHF8mRNA的表 达 分 别为（2.01±0.41）和（0.20±0.06），表明miR-1277-5p可 抑 制PHF8 mRNA的 表 达（t=4.32，P＜0.01）。

图4 miR-1277-5p与PHF8 mRNA的互补结合位点

2.5 miR-1277-5p对PHF8蛋白表达的影响Western blot结果表明（图5），与NC组相比，miR-1277-5p组SKOV-3细胞PHF8蛋白减少，周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）表达降低，抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达降低。

图5 高表达miR-1277-5p对SKOV-3细胞PHF8蛋白表达的影响

3 讨 论

研究显示，卵巢癌的发生、发展受miRNA的调控［3，8］。miRNA如miR-485-5p［9］、miR-665［10］在卵巢癌中高表达，可促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。miRNA如miR-584［11］、miR-199b-3p［12］在卵巢癌中低表达，抑制卵巢癌的发生和发展。通过研究miRNA对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响来寻找肿瘤治疗靶点，已成为当前卵巢癌治疗领域研究的热点。Wei等［7］研究显示，miR-1277-5p在胃癌组织中低表达，上调miR-1277-5p可抑制胃癌细胞的增殖和转移，miR-1277-5p在胃癌中发挥肿瘤抑制作用。miR-1277-5p在卵巢癌细胞中的作用并不清楚。本研究表明，过表达miR-1277-5p后，卵巢癌SKOV-3细胞增殖降低，细胞凋亡增多，可见miR-1277-5p在卵巢癌细胞中表现为抑癌基因的作用。

miRNA主要通过结合靶基因mRNA的非翻译区，抑制mRNA的翻译或者直接诱导其降解，从而干扰靶基因蛋白的表达［13-14］。本研究通过RNAhybrid预测miR-1277-5p的靶基因可能是PHF8。PHF8蛋白是一种组蛋白去甲基化酶，通过去甲基化修饰组蛋白的赖氨酸残基，调控基因的表达［15］。PHF8在前列腺癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤中高表达，参与调控肿瘤细胞的分化、增殖、凋亡等生物学行为，促进肿瘤的发生和发展［16］。本研究显示，增强miR-1277-5p表达后SKOV-3细胞中PHF8基因表达明显降低，提示miR-1277-5p可靶向抑制PHF8的表达。miR-1277-5p抑制PHF8表达后，SKOV-3细胞中增殖相关蛋白CDK2表达降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，表明SKOV-3细胞的增殖降低、凋亡增加。

综上所述，增加miR-1277-5p表达可降低卵巢癌SKOV-3细胞的增殖、诱导细胞凋亡，其可能是通过抑制PHF8基因表达实现，miR-1277-5p在卵巢癌的靶向治疗中可能具有一定的应用前景。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。