响应面法优化大蓟根总黄酮纯化工艺及其纯化前、后的抑菌活性比较

牛鹤丽

（白城医学高等专科学校，吉林白城 137000）

大蓟（Cirsium japonicumDC.）为菊科蓟族蓟属多年生宿根草本植物，具有药食两用特性，富含黄酮类、多酚类、咖啡酸酯类等活性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂及增强机体免疫等活性[1−2]，常作为保健食品的主要成分。

黄酮类物质指多个含有酚羟基的苯环直接连接形成的一系列化合物，作为大蓟的重要生物活性成分之一，对其提取和生物活性的研究较多。其中，马勤[3]通过动物试验发现大蓟根部黄酮提取物具有良好的抗氧化、抗炎活性及护肝作用；Liu 等[4]从大蓟中分离出两种黄酮类化合物柳穿鱼叶苷和柳穿鱼黄素，并以H22 和S180 小鼠为肿瘤模型，结果表明大蓟总黄酮和两个黄酮类化合物均可抑制癌细胞的生长；Lee 等[5]研究表明大蓟叶粗提物可以剂量依赖性抑制LPS 诱导巨噬细胞的亚硝酸盐生成；管春平等[6]采用正交试验法优化乙醇浸提大蓟总黄酮的工艺条件，并发现其对羟基自由基的清除效果优于芦丁和二丁基羟基甲苯（BHT），然而该黄酮提取物中仍含有鞣质、色素等杂质，可能影响其活性效果。由于目前大蓟根黄酮提取物的纯化及抑菌活性研究鲜有提及，而大孔树脂吸附已被广泛用于黄酮类物质的纯化[7−9]，因此本研究利用其具有机械筛分与化学吸附的特点，探讨大孔树脂于不同纯化工艺条件下，对产物中黄酮化合物的回收率影响，同时比较纯化前、后产物对不同供试菌的抑菌效果，从而为大蓟黄酮类物质的后续开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大蓟 采购于白城市吉林大药房，经白城医学高等专科学校刘大伟老师鉴定为菊科植物大蓟的干燥根；芦丁标准品 中国食品药品检定研究院（批号：100080-201811）；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；AB-8、DM 130 型大孔树脂 天津浩聚树脂科技有限公司；H-103、D101、DM 301 型大孔树脂 沧州宝恩吸附材料科技有限公司；HPD-400、HPD-600、NKA-II 大孔树脂 天津西金纳环保材料科技有限公司；牛肉蛋白胨琼脂培养基 自制；大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 吉林北方微生物研究所；灭菌注射用水 华润双鹤药业股份有限公司；实验用水 为超纯水。

N5000 型紫外-可见分光光度计 青岛精诚仪器仪表有限公司；FA124 型电子天平 上海恒平科学仪器有限公司；RE-2000A 型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；OLB-100B 型恒温振荡器 山东博科科学仪器有限公司；FC-10AE 型冷冻干燥机 河北国辉实验仪器有限公司；JC-150-SE 型恒温恒湿培养箱青岛精诚仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮提取物制备 参考相关文献操作[6]，采用溶剂提取法制备大蓟总黄酮提取物，具体如下：将大蓟根完全粉碎后，过80 目筛，称取干粉50 g，置于300 mL 体积分数为70%乙醇溶液内，水浴85 ℃恒温加热1.5 h 后过滤，重复上述操作，合并两次滤液，旋转蒸发回收乙醇后，冷冻干燥，即得粗品，纯化时以水为溶剂，配制成不同浓度的上样液。

1.2.2 产物的纯度测定 参考相关文献步骤[10]，准确称取芦丁对照品10.0 mg，置于50 mL 容量瓶内，加入30%乙醇溶液定容后，摇匀。分别准确移取0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 mL 置于10 mL 容量瓶内，依次加入5%亚硝酸钠和10%硝酸铝溶液0.3 mL后，静置6 min，继续加入4%氢氧化钠2 mL，采用30%乙醇溶液定容后，摇匀，于510 nm 波长处测定吸光度值，以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：y=7.015x+0.012（r=0.9995），同时于相同波长，测定其它样品的吸光度值，通过标准曲线方程，确定样品中黄酮含量，另将纯化后的洗脱液减压蒸发，浓缩干燥后称重，根据下式计算纯化产物的总黄酮纯度。

1.2.3 树脂的静态吸附-洗脱性能比较 准确称取预处理后[11]的不同类型树脂3.00 g，置于3 mg/mL 提取液50 mL 中，于室温下振荡吸附至饱和后，测定溶液中黄酮含量，随后采用纯化水冲洗树脂后，置于锥形瓶内，加入体积分数为70%乙醇100 mL，于室温振荡解吸至平衡，测定乙醇溶液中黄酮含量，按照文献所列公式[12]，测得不同类型树脂的吸附率、洗脱率和黄酮回收率。

式中：me为吸附平衡后总黄酮质量，mg；m0为样液初始总黄酮质量，mg；md为洗脱液中总黄酮质量，mg；Qe为饱和吸附率，%；Dd为洗脱率，%；R 为回收率，%。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 吸附条件考察 采用湿法将30 mL 活化的D101 型树脂装入层析柱（径高比为1:5）内，分别考察不同的上样液质量浓度、上样液pH 与上样流速对树脂吸附效果的影响，具体如下：a.当上样液pH 为5.0、体积为70 mL，上样流速为1.0 mL/min 时，上样液质量浓度分别为：1、2、3、4、5 mg/mL；b.当上样液质量浓度为3 mg/mL，上样流速为1.0 mL/min，上样液体积为70 mL 时，上样液pH 分别为：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；c.当上样液质量浓度为3 mg/mL，上样液pH 为5.0 时，绘制上样流速分别为1.0、2.0、3.0 mL/min时泄漏曲线。

1.2.4.2 洗脱条件考察 以乙醇作洗脱剂，分别考察乙醇体积分数与洗脱流速对吸附于树脂中黄酮的洗脱效果影响，具体如下：a.当洗脱流速为1.0 mL/min时，乙醇体积分数分别为：50%、60%、70%、80%、90%；b.当乙醇体积分数为70%时，绘制洗脱流速分别为1.0、2.0、3.0 mL/min的洗脱曲线。

1.2.5 响应面试验 固定上样液体积70 mL、上样流速1.0 mL/min、洗脱流速1.0 mL/min、洗脱液体积180 mL，以上样液质量浓度（A）、上样液pH（B）和乙醇体积分数（C）为响应因素，黄酮回收率为响应值（Y），设计三因素三水平的响应面试验，确定最佳纯化工艺条件，试验因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface design

1.2.6 抑菌活性实验

1.2.6.1 菌种活化与溶液配制 在牛肉膏蛋白胨培养基中分别接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌，于37 ℃培养24 h，制得105CFU/mL 菌悬液后，吸取2 mL 涂布于平板中，制成含菌平板[13]。另采用无菌水分别溶解纯化前、后产物，制得10.0 mg/mL样品溶液。

1.2.6.2 抑菌活性比较 采用“滤纸片法”考察纯化前、后产物的抑菌活性，将灭菌圆纸片（直径6 mm）分别浸泡于相同浓度的不同样品溶液中2 h 后，贴于不同含菌平板中，于37 ℃培养24 h，测定抑菌圈直径，另以无菌水作阴性对照[14]。

1.3 数据处理

每组试验平行三次，试验结果采用平均值±标准差表示，并采用SPSS 19.0 进行方差分析，检验水准α=0.05，当P<0.05 表示具有显著性差异，P<0.01 表示具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂种类筛选

不同类型树脂的孔径、比表面积与极性差异较大，因此吸附黄酮化合物的效果不同。八种树脂对大蓟黄酮化合物的静态吸附与解吸效果，见表2 所示。不同类型树脂对黄酮化合物的吸附具有一定选择性，其中H 103 树脂对黄酮化合物的吸附率最高，达到89.4%，这归因于该树脂的比表面积（≥900 m2/g）与平均孔径（85～95 nm）均较大[15]，且为非极性树脂，因此与黄酮化合物具有较好的相互作用，但D 101型树脂相对于H 103 型树脂的解吸率更高，且回收率为73.7%。这与李倩等[16]采用D 101 树脂吸附新疆圆柏黄酮结果较为相近，同时D101 树脂的成本适宜，因此确定采用D 101 型树脂纯化大蓟黄酮提取物。

表2 不同类型树脂的静态吸附-解吸结果Table 2 Static adsorption and desorption performance of macroporous resins of different types

2.2 动态吸附实验结果

2.2.1 上样液质量浓度选择 不同质量浓度的上样液对树脂吸附大蓟根黄酮化合物的影响，见图1 所示。随着上样液质量浓度的增大，吸附率先缓慢增大后逐渐减小。这归因于上样液质量浓度越低，黄酮化合物被树脂吸附的越充分，但吸附量较少，而伴随上样液浓度的增大，树脂的吸附效果受其吸附位点的数量影响，吸附量与吸附率均减小[17]，考虑到上样液浓度过低时，树脂的纯化效率较小，而浓度过高时，又造成物料的浪费，因此以2.0、3.0、4.0 mg/mL 上样溶液作为响应面试验因素考察水平。

图1 上样液浓度对吸附率的影响Fig.1 The effect of sample solution concentration on adsorption rate of resin

2.2.2 上样液pH 选择 上样液pH 对树脂吸附大蓟根黄酮化合物的影响，见图2 所示。从图2 可知，随着上样液pH 增大，吸附率先升高，至pH 为5.0 时开始下降，这归因于黄酮化合物的结构中存在较多酚羟基，当溶液pH 不同时，其存在形式有所变化，在pH 较低溶液中，易形成“徉盐”，而在pH 过高溶液中，易以离子态存在[18]，均不利于黄酮化合物的物理吸附，因此以上样液pH4.0、5.0、6.0 作为响应面试验因素考察水平。

图2 上样液pH 对吸附率的影响Fig.2 The effect of pH of sample solution on adsorption rate of resin

2.2.3 不同上样流速时的泄漏曲线 当泄漏液中黄酮化合物浓度约为上样液浓度的1/10 时，则认为树脂开始出现泄漏，称为“泄漏点”[19]，分别考察不同上样流速时D101 型树脂的泄漏曲线，如图3 所示。随着上样流速的加快，树脂泄漏点对应的上样液体积不断减小，分别约为70、50、30 mL。这源于黄酮化合物在树脂内的物理吸附，依赖于膜扩散与粒扩散效应，若流速过慢，树脂与溶液接触充分，但流速过快，使得扩散效应降低[20]，因此确定最佳上样流速为1.0 mL/min，上样体积为70 mL。

图3 不同上样流速的泄漏曲线Fig.3 The leakage curve of different flow velocity

2.3 动态洗脱实验结果

2.3.1 洗脱剂体积分数的选择 不同体积分数的洗脱液对大蓟根黄酮化合物的洗脱率影响，如图4 所示。随着乙醇体积分数增大，洗脱率逐渐升高，随后缓慢下降。这归因于乙醇的体积分数较低时，吸附在树脂内的黄酮化合物不易溶出，而体积分数过高，又使得部分醇溶性杂质从树脂解吸脱附[21]，因此以乙醇体积分数60%、70%、80%作为响应面试验因素考察水平。

图4 乙醇体积分数对洗脱率的影响Fig.4 The effect of ethanol concentration on desorption rate

2.3.2 不同洗脱流速时的洗脱曲线 不同洗脱流速下饱和吸附后树脂的洗脱曲线，见图5 所示。伴随洗脱流速加快，洗脱曲线峰形逐渐变宽，同时洗脱剂消耗量增多。与其它洗脱流速相比，当采用体积分数为70%乙醇溶液以1.0 mL/min 流速洗脱时，洗脱曲线的峰型明显集中、对称，于180 mL 洗脱液下基本洗脱完全，因此确定最佳洗脱流速为1.0 mL/min，洗脱液用量180 mL。

图5 不同流速的洗脱曲线Fig.5 The dynamic desorption curve of different flow velocity

2.4 响应面试验结果及分析

2.4.1 响应面试验结果 根据单因素实验结果，采用Box-Behnken 设计原理，进行三因素三水平的RSM 分析试验，分别考察上样液质量浓度（A）、上样液pH（B）和乙醇体积分数（C）对黄酮化合物回收率（Y）的影响，结果见表3。

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Design and results of the response surface experiment

2.4.2 方差分析 采用多元回归拟合上述试验结果，得到以回收率为目标函数，各参数编码值的多元二次方 程 ：Y=69.32−0.25A−0.16B+0.037C−0.33AB−0.18AC−0.30BC−3.29A2−2.46B2−1.46C2，对其进行显著检验与方差分析，结果见表4。

表4 响应面方差分析Table 4 The variance analysis of response surface experiment

从表4 可知，该回归模型P<0.01，表明二次回归方程模型显著，失拟项P=0.5921>0.05 表明该回归方程拟合度较高，R2=0.9949 表明模型可充分拟合试验数据。通过该模型的方差分析可知：在所有作用因素中，一次项A、交互项AB 对黄酮的回收率影响显著（P<0.05），二次项A2、B2、C2的影响极其显著（P<0.01）。从表中F值可知，各因素对黄酮回收率的影响顺序为：上样液质量浓度（A）>上样液pH（B）>乙醇体积分数（C）。

2.4.3 交互作用分析 不同因素交互影响黄酮化合物回收率的响应曲面，见图6 所示。所有响应面开口均向下，回收率与三个考察因素呈明显的二次抛物关系，随着各因素值增大，响应值逐渐升高，随后呈现不同斜率的下降，各曲面均有稳定点，即为极大值[22]。通过对二次抛物线函数模型进行极值分析，得到D101 型大孔树脂纯化大蓟根黄酮化合物的最佳工艺条件为：质量浓度为2.96 mg/mL，pH4.97的大蓟黄酮提取液70 mL，以1.0 mL/min 流速上样后，经180 mL 体积分数为70.2%乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脱，对黄酮化合物的理论回收率为70.3%，实际回收率为69.8%±1.1%，与模型预测值较接近。产物的黄酮纯度由23.2%±0.7%提高至67.4%±0.9%，约为纯化前2.9 倍。李侠等[23]采用AB-8 树脂纯化绿豆皮黄酮，产物纯度约为纯化前2.2 倍，而冯靖等[24]采用HPD-100 树脂纯化银杏叶黄酮，产物纯度约为纯化前3.0 倍，表明该工艺条件纯化大蓟根总黄酮提取物的效果较佳。

图6 两因素交互作用对回收率的影响Fig.6 The influence of the interaction of two factors on the recovery rate

2.5 抑菌活性结果比较

纯化前、后大蓟根黄酮化合物对不同受试菌的抑菌效果，见表5 所示。从表5 可知，该黄酮化合物对三种受试菌均有一定的抑菌作用，抑菌效果由小到大排序为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，这与王家皓等[25]考察南苜蓿叶黄酮的抑菌性能结果相近，而纯化后黄酮化合物的三种抑菌圈直径均明显大于该提取物，具有显著性差异（P<0.05），表明采用大孔树脂纯化大蓟黄酮提取物，有助于进一步增强其抑菌活性。

表5 不同样品的抑菌圈直径（n=3）Table 5 Inhibition zone diameter of different materials (n=3)

3 结论

本研究探讨了大孔树脂纯化大蓟根黄酮的最佳工艺条件并分析其抑菌活性。试验结果表明，质量浓度为2.96 mg/mL，pH4.97的大蓟黄酮提取液70 mL，以1.0 mL/min 流速上样后，经180 mL 体积分数70.2%乙醇溶液，以1.0 mL/min 流速洗脱，产物的黄酮纯度由23.2%±0.7%提高至67.4%±0.9%，约为纯化前2.9 倍。通过体外抑菌活性试验结果表明，与提取物相较，纯化后的产物对大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用均有显著性提高（P<0.05），表明其抑菌活性更好，因此可为大蓟根黄酮化合物的相关开发与利用提供参考。